مقالة منهجية

تحديد الأنواع الفرعية لخلايا العقدة الشبكية للفأر من خلال تتبع الفلورسنت

مايو 29, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Laboissonniere, et. al. تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لمجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو تقنية تتبع الفلورسنت لتحديد الأنواع الفرعية للخلايا العقدية الشبكية (RGC) في شبكية الفأر المعدلة وراثيا. تتضمن العملية تأمين شبكية العين المعزولة في غرفة التسجيل ، والحفاظ على صلاحية الخلية من خلال التروية المؤكسجة ، واستهداف RGCs المسمى بالفلورسنت باستخدام ماصة مع متتبع. من خلال تحليل التشكل الشجيري والتقسيم الطبقي ، تتيح الطريقة تصنيف الأنواع الفرعية المميزة ل RGC.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل المراجعة الأخلاقية المناسبة للحيوانات.

1. تحضير أنسجة الشبكية (2 ساعة)

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات في هذا القسم تحت إضاءة حمراء خافتة

  1. المتكيفة مع الظلام لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التشريح. قم بتنفيذ جميع الإجراءات تحت إضاءة حمراء خافتة.
  2. القتل الرحيم للحيوانات عن طريق الاختناق عن طريق CO2 اختناق مقل العيون وإخراج مقل العيون إلى طبق بتري بمحلول خارج الخلية مؤكسج سابقا.
  3. كزة القرنية بإبرة وقطعها عن طريق قصها بمقص للعيون عند حدود القرنية والصلبة.
  4. قم بإزالة العدسة باستخدام ملقط # 5. قم بتمزق الصلبة برفق باستخدام الملقط وقطع العصب البصري حيث تلتقي شبكية العين والصلبة. قم بإنهاء إزالة الصلبة من شبكية العين بعناية.
  5. إزالة الجسم الزجاجي الشفاف باستخدام ملقط # 5 ؛ بمجرد إزالته ، يظهر الجسم الزجاجي كمادة هلامية عالقة بالملقط. قطعي شبكية العين إلى نصفين (بحيث يكون هناك 4 قطع /) وخزنيها في محلول مؤكسج خارج الخلية في RT حتى الاستخدام.
  6. عندما تكون جاهزا لتركيب الأنسجة في غرفة التسجيل ، ضع قطعة من شبكية العين لتحتضن في محلول إنزيمي مخفف في 500 ميكرولتر من محلول مؤكسج خارج الخلية. احتضن في طبق بتري لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر.
    1. اغسل قطعة شبكية العين في محلول مؤكسج خارج الخلية وضع الأنسجة في غرفة تسجيل زجاجية القاع ؛ استخدم ماصة نقل بلاستيكية مع قطع طرفها للسماح بنقل شبكية العين دون التسبب في تلف الأنسجة.
  7. استخدم الملقط لتسطيح الأنسجة بعناية بحيث تكون طبقة المستقبلات الضوئية متجهة لأسفل. قم بإزالة السوائل الزائدة باستخدام ماصة. قم بتثبيت المنديل باستخدام حلقة بلاتينية بشبكة من النايلون.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتحضير الأنسجة لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا الآمكرين وثنائية القطب المصنفة.
  8. املأ الغرفة بمحلول مؤكسج خارج الخلية وقم بتثبيتها على مرحلة المجهر. أنسجة مرفوعة بمحلول مؤكسج خارج الخلية عند 2-4 مل / دقيقة.

3. تصور واستهداف خلايا العقدة الشبكية GFP + (10 دقائق)

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات في هذا القسم تحت إضاءة حمراء خافتة

  1. قبل البدء سحب الماصات الدقيقة الزجاجية (القطر الخارجي [OD]: 1.2 مم، القطر الداخلي [ID]: 0.69 مم) للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية باستخدام مجتذب الماصات الدقيقة. استخدم البروتوكول التالي للأقطاب الكهربائية (يرجى ملاحظة أنه يجب ضبط المعلمات وفقا لذلك لتحقيق المقاومة المطلوبة وستختلف عبر ساحبات وزجاج مختلف): الحرارة: منحدر +10 ؛ السحب: 0 ؛ : 23; التأخير: 1; الضغط: 500 ؛ حلقة البرنامج: 5 مرات. تأكد من أن الأطراف يبلغ قطرها ~ 1 ميكرومتر ، مع مقاومة 2-4 MΩ لاستهداف الخلايا الكبيرة و 5-7 MΩ لاستهداف الخلايا الأصغر.
  2. راقب طبقة الخلية العقدية باستخدام بصريات تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) ( الشكل 1A). حدد البروتين الفلوري الأخضر (GFP) + الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) باستخدام التألق السطحي (~ 480 نانومتر) ( الشكل 1 ب ).
  3. حدد موقع الماصة المملوءة بمحلول داخل الخلايا في DIC. قم بتطبيق ضغط إيجابي طفيف وإزاحة جهد صفري على مكبر الصوت.
  4. اضغط على الماصة الدقيقة الزجاجية مقابل خلية GFP+ واضغط على الضغط السلبي لتشكيل مانع تسرب GΩ بين الماصة وغشاء الخلية. قم بتطبيق خطوات أمر جهد الاختبار ( على سبيل المثال، 5 مللي فولت) لمراقبة مقاومة الختم. بعد تشكيل ختم مستقر ، قم بتمزيق الغشاء عن طريق تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي للوصول إلى الخلية بأكملها.
  5. انتظر 1-2 دقيقة حتى تمتلئ تشعبات الخلية بتتبع الفلورسنت.
    ملاحظة: يمكن كتابة الخلية شكليا عن طريق فحص التشكل في التألق السطحي ( الشكل 1C). في حالة RGCs التي تعبر عن الميلانوبسين ، يتم تصور التقسيم الطبقي الشجيري في الطبقة الداخلية للضفيرة من خلال فحص التشعبات المملوءة بتتبع الفلورسنت تحت إضاءة epifluorescent وتحديد ما إذا كانت تنقسم إلى طبقات بعيدا عن soma في OFF sublamina (M1 ipRGCs) ، بالقرب من طبقة الخلية العقدية في ON sublamina (M2 & M4 ipRGCs) ، أو كليهما (M3 ipRGCs). تسمح هذه الملاحظة ، جنبا إلى جنب مع حجم سوما (M4s لها سوما كبيرة بشكل واضح مقارنة بجميع الأنواع الفرعية الأخرى من ipRGC) ، بتحديد نوع الخلية. وبالتالي ، تسمح هذه التقنية بتحديد نوع الخلية في المختبر قبل عزل الحمض النووي الريبي. يمكن تعديل هذه الطريقة لبروتوكولات تحديد نوع الخلية الأخرى التي تتضمن إما مورفولوجيا التغصني أو علم وظائف الأعضاء الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

الشكل 1: تحديد أنواع RGCs بنا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: fixed ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets baot = '1' >قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات diethyl pyrocarbonate (DEPC)Sigma AldrichD5758 Alexa Fluor 594 HydrazideInvitrogenA10442 ptri plate (35mm diameter)thermo نمط فيشر العلمي < td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>153066 < نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < tr style = 'الارتفاع: 20 بكسل ؛ '>< td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> مقص العيون < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;' > Fine Science Tools15000-00 #5 FallpsFine Science Tools11252-30< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Glass MicropipetteSutterBF120-69-10 مجتذب الماصة الدقيقة < td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>Sutter < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom;'> P-1000 مجتذب الماصة الأفقي1 مل حقنةFisher Scientific14-823-2F

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة