مقالة منهجية

التصوير الفلوري مدى الحياة لتراكم بروتين PolyQ في الخلايا العصبية Caenorhabditis elegans

يونيو 17, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Pigazzini, M. L., et. al. توصيف هياكل الأميلويد في الشيخوخة {{}}C. Elegans باستخدام التصوير مدى الحياة الفلوري. {{{}} (2020).

يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة الفلورية (FLIM) لتقييم تراكم بروتين polyQ في C. elegans الخلايا العصبية ، ومقارنة الديدان التي تعاني من نقص البروتين ومرافقة. يعزز التراكم المتزايد في الديدان التي تعاني من نقص المرافق نقل الطاقة بين الفلوروفورات العنقودية ، مما يقلل من عمر الفلورة. تصور الخرائط المرمزة بالألوان التي تم إنشاؤها بواسطة FLIM هذه الاختلافات ، مع تسليط الضوء على مستويات التجميع بين المجموعات التجريبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الحصول على بيانات FLIM

}ملاحظة: { في هذا البروتوكول ، يتم الحصول على عمر الفلوروفور عبر طريقة TCSPC للمجال الزمني. يتطلب FLIM نبضة من الضوء ليتم إنشاؤها بواسطة الليزر بمعدل تكرار محدد وثابت. يختلف معدل التكرار وفقا لنوع الليزر ويجب أن يكون معروفا من قبل المستخدم. يتم تحقيق قياسات العمر الافتراضي بواسطة أجهزة الكشف والمعدات الإلكترونية المثبتة جنبا إلى جنب مع المجهر التقليدي. في هذا البروتوكول ، يتم إجراء القياسات على ثلاثة مجاهر مختلفة للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر مع كاشفات وبرامج مقدمة من شركتين مختلفتين ( جدول المواد ) للحصول على mRFP و CFP و YFP ، على التوالي. تحقق من وجود المرشحات الصحيحة للانبعاث / الإثارة في مكانها وقلل من أي خلفية أو إضاءة خلفية للشاشة قبل البدء. قبل البدء في أي تجربة ، قم بإنشاء الثبات الضوئي للفلوروفور المختار. إذا تم تبييض الفلوروفور في غضون فترة زمنية قصيرة داخل أنسجة الديدان الخيطية ، فهو غير مناسب لقياسات FLIM في C. elegans .

  1. افتح برنامج اكتساب FLIM. يسمح برنامج FLIM أيضا بالتحكم في المجهر متحد البؤر. حدد موقع علامة التبويب / الزر للسماح بتمكين مخرجات الكاشف واضغط على تمكين المخرجات.
  2. احصل على وظيفة استجابة الأداة (IRF) ، والتي تصف دقة توقيت الإعداد الآلي.
    ملاحظة: يفضل تنفيذ هذه الخطوة قبل تركيب الديدان الخيطية.
    1. إذا كان ذلك متاحا ، فقم بإزالة مرشحات الإثارة / الانبعاث.
    2. ضع غطاء فارغا فوق الهدف وابحث عن سطحه. سجل إشارة التشتت التي تم الحصول عليها من قسيمة الغطاء لمدة لا تقل عن 30 ثانية.
      ملاحظة: لعمر عدة نانوثانية، يمكن لبرنامج الاستحواذ تقدير تحول IRF تلقائيا. يوصى دائما بالحصول على IRF.
  3. ضع الشريحة مع C. elegans على المسرح. استخدام عدسة تكبير 10x في وضع الإرسال وتحديد موضع الديدان الخيطية على الشريحة.
  4. قم بإزالة الشريحة، وقم بتبديل الهدف إلى عدسة تكبير 63x، وقم بتطبيق وسط الغمر المطلوب (على سبيل المثال، الزيت). استبدل الشريحة على المسرح وقم بتوطين الديدان الخيطية.
  5. حدد موقع مدير الثقب على برنامج الاستحواذ وافتحه على الحد الأقصى. ابدأ في مسح العينة ضوئيا، وحدد منطقة الاهتمام (على سبيل المثال، الرأس، الجزء العلوي من الجسم)، وركز على مستوى الإسقاط الأقصى.
  6. راقب معدل نبض الليزر والقيم الثلاث الأخرى الموجودة على واجهة البرنامج: ميز الكسر الثابت (CFD) و الوقت إلى السعة (TAC) و{ المحول التناظري إلى الرقم (ADC).
    ملاحظة: يجب أن يكون لليزر بوابة كحد أقصى 1 × 10 8 عدد فوتونات مفردة. يمثل هذا الرقم الحد الأقصى لعدد الفوتونات التي يوفرها الليزر. يوفر CFD معلومات عن استلام نبضة الفوتون الفردي في إشارة إلى نبضة الليزر بواسطة الكاشف. يجب أن تكون هذه القيمة تقريبا 1 × 105. يميز TAC بين الوقت الذي تم فيه اكتشاف فوتون واحد ونبض الليزر التالي. أخيرا ، يقوم ADC بتحويل جهد TAC إلى إشارة ذاكرة قابلة للتخزين. يجب أن يكون لكل من CFD و TAC و ADC قيم متشابهة لضمان عدم فقد الفوتونات المنبعثة من الفلوروفور. يضمن التقييم الصحيح لهذه المعلمات جمع عدد كاف من الفوتونات لإنشاء خريطة دقيقة للعمر.
  7. على واجهة برنامج FLIM ، قم بمعاينة عدد الفوتونات المكتشفة: يجب أن تكون قيمة ADC بين 1 × 10 4 TAG_171 . إذا لزم الأمر ، قم بتحويل التركيز إلى مستوى مختلف أو قم بزيادة طاقة الليزر لجمع المزيد من الفوتونات.
    ملاحظة: بشكل عام ، يجب ألا يتجاوز عدد الفوتونات المسجلة في الثانية 1٪ من معدل تكرار الليزر.
  8. في شريط القائمة، حدد علامة التبويب لتعيين معلمات الاكتساب. حدد مزامنة المسح الضوئي في للسماح باكتشاف الفوتون الفردي.
  9. اضبط الاستحواذ على فترة زمنية محددة أو عدد ثابت من الفوتونات. على سبيل المثال ، احصل على منحنى اضمحلال مدى الحياة لمدة دقيقتين أو حتى يصل بكسل واحد إلى عدد الفوتون البالغ 2,000 حدث فردي. اضغط على ابدأ لبدء الاستحواذ.
    ملاحظة: تتطلب الفلوروفورات المختلفة ليزر ومرشحات مختلفة للإثارة والانبعاث. وفقا لسطوع العينة ، يمكن أيضا ضبط طاقة الليزر ، والتي لن تتداخل مع العمر. تستخدم هذه البروتوكولات إعدادات الإثارة / الانبعاث التالية: YFP ex500 / em520-50 نانومتر ، mRFP ex561 / em580-620 نانومتر. تم استخدام ليزر فوتونين نابض لقياسات CFP باستخدام ex800 / em440 نانومتر. يجب تحديد مقدار الوقت وعدد الفوتونات المطلوبين للحصول على خريطة FLIM تجريبيا لكل إعداد وكل غرض تجريبي.

2. تحليل بيانات FLIM باستخدام برنامج FLIMfit

ملاحظة: قم بإجراء تحليل البيانات باستخدام أداة برنامج FLIMfit التي تم تطويرها في إمبريال كوليدج لندن (انظر الشكل 1).

  1. افتح البرنامج واستورد ملفات بيانات FLIM عبر ملف | تحميل بيانات FLIM. قم بتحميل جميع العينات من حالة واحدة ، حتى لو تم الحصول عليها في جلسات مختلفة ومن تكرارات بيولوجية مختلفة.
  2. إذا لزم الأمر ، قم بتقسيم الديدان الخيطية المفردة من أي صورة FLIM عبر التجزئة | مدير التجزئة. اسحب أداة الاقتصاص حول منطقة الاهتمام حتى يتم تمييزها. بمجرد الانتهاء، اضغط على OK.
    ملاحظة: يجب أن يتم التجزئة لجميع الصور.
  3. حدد منطقة صغيرة حيث تظهر الصورة المستندة إلى الكثافة ل C. elegans ( الشكل 1، الأسهم 1). سيظهر منحنى الاضمحلال لتلك المنطقة في نافذة الاضمحلال الكبيرة على الجانب الأيمن من الواجهة ( الشكل 1 ، السهم 2).
    ملاحظة: يمكن عرض الاضمحلال خطيا أو لوغاريتميا.
  4. قم بتعيين المعلمات الصحيحة لاستقراء العمر الافتراضي عبر خوارزمية البرنامج كما هو موضح في الخطوات 2.5-2.8.
  5. في علامة التبويب { البيانات { الشكل 1، السهم 3):
    1. TAG_348 TAG_347{{}} الحد الأدنى المتكامل لاستبعاد أي وحدات بكسل خافتة جدا بحيث لا يمكن إنتاج مناسب جيد. اعتمادا على عينة C. elegans ، تختلف هذه القيمة من 40-300. أدخل قيما مختلفة حتى يتم تحقيق معاينة مرضية.
    2. حدد الحد الأدنى للوقت و الحد الأقصى للوقت للحد من إشارة FLIM بهذه القيم. سيتم استبعاد جميع الأحداث التي تظهر قبل هذا الحد وبعده.
      ملاحظة: على سبيل المثال، لتحليل mRFP، تم استبعاد الأحداث التي تسبق 800 ps وبعد 4,000 ps. تعتمد هذه القيم على عمر الفلوروفور ويجب أن يحددها المستخدم النهائي.
    3. لا تقم بتغيير الإعداد المسبق التهم / الفوتون من 1.
    4. أدخل معدل التكرار، بالميجاهرتز، لليزر المستخدم أثناء الاستحواذ.
      ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول الحالي ، تم استخدام ليزر مختلف بمعدلات تكرار مختلفة. يمتلك ليزران الفوتون المستخدم للحصول على عمر CFP معدل تكرار قدره 80 ميجاهرتز ، وبالنسبة ل YFP يتكرر الليزر عند 40 ميجاهرتز ، وبالنسبة ل mRFP ، تكون القيمة 78.01 ميجاهرتز. تم إدخال هذه القيم في FLIMfit وفقا للعينة التي تم تحليلها.
    5. أدخل قيمة Gate Max لاستبعاد جميع وحدات البكسل المشبعة.
      ملاحظة: بالنسبة للقياسات مدى الحياة في C. elegans، يتم تعيين هذه القيمة على أي رقم كبير (على سبيل المثال، 1 × 108{).
  6. في علامة التبويب مدى الحياة، حدد ملاءمة عامة لاستخدامها (على سبيل المثال، تركيب بكسل). انظر الشكل 1، السهم 4.
    ملاحظة: {{TAG_480}TAG_481} سينتج عنه تكويس مناسب لكل بكسل على حدة. سينتج عن التركيب من حيث الصورة ملاءمة عالمية لكل صورة على حدة وعرض قيمة عمر واحدة لكل صورة. سينتج عن التركيب من الناحية العالمية ملاءمة واحدة عبر مجموعة البيانات بأكملها. يتم توفير قيمة عمر واحدة لجميع الصور.
  7. لا تقم بتغيير أي معلمة أخرى باستثناء لا. اختيار Exp إذا كان من المعروف أن اضمحلال التألق المختار متعدد الأس ويظهر أكثر من عمر واحد.
    ملاحظة: في البروتوكول الحالي ، تم استخدام هذه الوظيفة لحساب عمر فلوروفور CFP ثنائي الأس.
  8. قم بتحميل IRF عبر قائمة IRF: IRF | قم بتحميل IRF. لتقدير تحول IRF ، حدد IRF | تقدير IRF Shift. ستظهر مجموعة من القيم تلقائيا في علامة التبويب IRF. بمجرد تحديد ذلك، لا تغير أي معلمات أخرى في علامة التبويب هذه.
  9. بمجرد تعيين جميع المعلمات، اضغط على مجموعة البيانات المناسبة ( الشكل 1, السهم 5). ستنتج الخوارزمية ملاءمة لمنحنى الاضمحلال وإنشاء قيمة مدى الحياة لكل صورة.
    ملاحظة: يجب أن يتداخل الملاءمة الناتجة ، المميزة بخط أزرق ، مع جميع الأحداث. يتم الحصول على ملاءمة جيدة عندما تتم محاذاة جميع الأحداث على طول الملاءمة.
  10. انقر فوق علامة التبويب المعلمات ( الشكل 1، السهم 6)، الموجود داخل القوائم العلوية اليمنى لواجهة البرنامج، وحدد الإحصاء: w_mean (المتوسط المرجح) وتحقق من chi2{{ TAG_598}} أقرب قيمة ممكنة إلى 1.
    ملاحظة: {{}TAG_610} chi2 قريب من واحد يضمن دقة الملاءمة. وهكذا يتم الكشف عن القيمة الدائمة للصورة المحددة على النحو التالي: {tau_1.
  11. تصدير أي معلومات تهم: ملف | تصدير صور الكثافة / ملاءمة جدول النتائج / الصور / الرسوم البيانية . احفظ إعدادات البيانات المستخدمة لحساب العمر الافتراضي: ملف | حفظ إعدادات البيانات.
    ملاحظة: سيتم حفظ المعلمات المستخدمة للتحليل المستقبلي للعينات المحددة.

3. التمثيلات الرسومية لبيانات FLIM

ملاحظة: يمكن تمثيل الأعمار التي تم جمعها من عينات مختلفة بصريا بطرق مختلفة. حدد للإشارة إلى قيم العمر إما بالنانو ثانية أو البيكو ثانية.

  1. أظهر جودة الملاءمة ودقة المنحنى عن طريق تصدير منحنى الاضمحلال مباشرة من FLIMfit.
  2. تمثيل توزيع الفوتونات عن طريق رسم تردد عدد الفوتونات مقابل قيمة العمر في الرسم البياني.
  3. أخيرا ، للمقارنة الإحصائية ، في حالة مقارنة عينتين أو أكثر ، ضع قيم العمر بالإضافة إلى الانحراف المعياري للمتوسط في رسم بياني شريطي مخطط مبعثر. قم بإجراء أي تحليل إحصائي مرغوب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: fixed ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets-baot = '1' >قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات AmpicillinK029.3< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسار: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ التفاف الإستراتيجية : 4 ؛ > B&H DCS-120 SPC-150 < TD style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحد السفلي: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >Becker & Hickl GmbH<td style = 'background-color: #ffffff ؛ border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '> FLIM Aquisition SoftwareB&H SPC830-SPC Image FLIM Aquisition SoftwareC. elegans nQ40-CFP< td style='background-color:#ffffff;border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> < td style = 'background-color: #ffffff ؛ border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-left: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ color: #1a202c ؛ font-size: 12pt ؛ overflow: hidden; padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top; a-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>Deckgläser-18x18mm< td style='background-color:#ffffff;border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;color:#1a202c;font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Carl Roth GmbH + Co. KGCover slipsLeica Camera AG < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> تصاعد المجهر المجسمLeica TCS SP5 Confocal Microscope< td style='background-color:#ffffff;border-bottom:1px solid #00000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;color:#1a202c;font-size:12pt;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Levamisole HydrochlorideA4341< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسرى : 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ > PicoQuant PicoHarp300 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحد السفلي: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >PicoQuant GmbH<td style='background-color: #ffffff؛ border-bottom: 1px solid #000000؛ border-right: 1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> FLIM Aquisition SoftwareSodium AzideK305.1< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسرى : 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية : أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ التفاف الإستراتيجية : 4 ؛ > القياسية - Objektträger < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحد السفلي: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >Carl Roth GmbH + Co. KG656.1< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليسرى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ > العالمي Agarose < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحد السفلي: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >Bio & Sell GmbH<td style='background-color: #ffffff؛ border-bottom: 1px solid #000000؛ border-right: 1px solid #000000؛ color: #1a202c؛ font-size: 12pt؛ overflow: hidden؛ boardding: 0px 3px؛ vertical-align: top؛ white-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4;'>BS20.46.500 < td style='background-color:#ffffff;border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;color:#1a202c;font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Zeiss AxioObserver.Z1 confocal microscope< td style='background-color:#ffffff;border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;color:#1a202c;font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Zeiss LSM510-Meta NLO مجهر متحد البؤر

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Fluorescence Lifetime ImagingPolyQ Protein AggregationCaenorhabditis elegans NeuronsConfocal MicroscopyFLIM AcquisitionFluorophore TaggingChaperone DeficiencyEnergy TransferColor Coded MapsLifetime Measurement

مقالات ذات صلة