الفحص المجهري ثنائي الفوتون لمراقبة ديناميكيات الكالسيوم في المستقبلات الضوئية المخروطية لشبكية العين

الملخص

المصدر: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca²⁺ ديناميكيات في محطات المحطات المحورية المستقبلة للضوء المخروطية لشبكية الفأر. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون لمراقبة ديناميكيات الكالسيوم في المستقبلات الضوئية المخروطية لشبكية الفأر المعدلة وراثيا. يحدد خطوات تحضير شرائح الشبكية ، وتصوير أجهزة الاستشعار الحيوية للكالسيوم القائمة على FRET ، وتحليل التغيرات الفلورية لتحديد مستويات الكالسيوم تحت إضاءة الخلفية وتحفيز الضوء.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. تحضير الشريحة (10 - 15 دقيقة)
   1. تحضير أغشية مرشح النيتروسليلوز مسبقا لتقطيع الشبكية والأغطية الزجاجية لتركيب الشرائح ونقلها إلى غرفة التسجيل. قطع غشاء مرشح النيتروسليلوز إلى قطع مستطيلة بحجم 10 × 5 مم تقريبا باستخدام المقص. قم بتقطيع الغطاء إلى قطع مستطيلة بحجم 10 × 5 مم تقريبا باستخدام قاطع الزجاج.
   2. اغمر شريحة زجاجية ببطء في المحلول خارج الخلية بالقرب من الأنسجة. برفق ، اسحب شريحة الشبكية التي تم الحصول عليها من HR2.1: TN-XL Ca ^{2 +} الماوس الحيوي على الشريحة الزجاجية مع جانب الخلية العقدية لأعلى عن طريق الإمساك بها من الحافة باستخدام زوج من الملقط. تقلل هذه العملية من التلف الميكانيكي وطي الأنسجة.
   3. اختر منطقة شبكية العين المرتبطة بسؤال البحث المعني. قم بقص قطعة مستطيلة ، حوالي 1 × 2 مم من منطقة الشبكية المحددة باستخدام شفرة مشرط منحنية. امسح المحلول الزائد حول الأنسجة.
   4. ضع غشاء المرشح أعلى قطعة الشبكية بحيث يلتصق جانب الخلية العقدية بالغشاء. على الفور ، أضف قطرة من الوسط خارج الخلية على الغشاء لربط الأنسجة بإحكام بالغشاء.
   5. انقل أنسجة الشبكية المثبتة على الغشاء إلى غرفة التقطيع التي تحتوي على محلول جديد خارج الخلية.
   6. قم بتقطيع شبكية العين إلى شرائح رأسية بسمك 200 ميكرومتر ( الشكل 1 ب ) باستخدام شفرة حلاقة جديدة متصلة بمفرمة المناديل. قم بتغيير الشفرة لكل قطعة من الشبكية.
      ملاحظة: يجب محاذاة شفرة الحلاقة تماما مع سطح قاع غرفة التقطيع بحيث ينقسم الغشاء بالكامل في وقت واحد ، كما يتضح من صوت "النقر" عند القطع. خلاف ذلك ، قد تنحني الشفرة وتتلف الشريحة.
   7. قم بلصق شريحة واحدة مثبتة على الغشاء على غطاء زجاجي عن طريق وضع شحم عالي التفريغ على نهايات الغشاء فقط ( الشكل 1C ). حافظ على السطح الزجاجي أسفل شبكية العين خاليا من الشحوم.
   8. احتفظ بالشرائح المثبتة على الغطاء مغطاة بقطرة من المحلول خارج الخلية في غرفة الاحتجاز - حاوية مغلقة ومقاومة للضوء ، على سبيل المثال ، طبق بتري مع غطاء مغطى بورق الألمنيوم - تحت جو كربوهيدروكسجين في درجة حرارة الغرفة (RT). أدخل الأكسجين الكربوهيدرات عن طريق فقاعات خزان مياه صغير للحفاظ على الغلاف الجوي في غرفة الاحتجاز رطبا ؛ هذا يمنع الشرائح من الجفاف.
   9. اترك الشرائح ترتاح في حجرة الاحتجاز لمدة 10-15 دقيقة قبل نقلها (واحدة تلو الأخرى) إلى غرفة التسجيل. يمكن الحفاظ على الشرائح لمدة تصل إلى 4-5 ساعات في غرفة الاحتجاز عند RT (~ 21 درجة مئوية).

2. تصوير ثنائي الفوتون Ca²⁺

1. المجهر ثنائي الفوتون
   1. استخدم مجهر ثنائي الفوتون من النوع (MOM).
      ملاحظة: يمكن استخدام أي مجهر ثنائي الفوتون المستقيم الذي يفي بالحد الأدنى من المتطلبات التالية: يجب أن يكون مزودا ب (a ) ليزر نبضي قابل للضبط على ~ 860 نانومتر ، ( ب ) على الأقل قناتين مضان مكتسبتين في وقت واحد ، مرشحات ( c ) لبروتين الفلورسنت السماوي المعزز (eCFP) ومضان السترين ، ( d) محفز ضوئي ، و ( e) برنامج يسمح بتسجيل تسلسلات الصور المنقضية بمعدل إطارات كاف لحل إشارات Ca ^{2 +} ذات أهمية.
   2. ابدأ نظام التصوير ثنائي الفوتون كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. اتبع بدقة إرشادات السلامة بالليزر الخاصة بالمنشأة. ابدأ تشغيل الليزر وضبطه على ~ 860 نانومتر.
   3. انقل شريحة من غرفة التثبيت إلى غرفة التسجيل وابدأ على الفور في الترشيح بمحلول خارج الخلية الكربوهيدراتية المؤكسج. حافظ على معدل تدفق التروية يبلغ 2 مل / دقيقة ودرجة حرارة 37 درجة مئوية في غرفة التسجيل.
   4. استخدم هدف الغمر في الماء بفتحة عددية (NA) 20X 0.95. إذا كان ذلك متاحا ، استخدم كاميرا الجهاز المقترن بالشحن (CCD) مع الصمام الثنائي الباعث للضوء بالأشعة تحت الحمراء (LED) أسفل غرفة التسجيل لتحديد موقع شريحة الشبكية ( الشكل 2 ). خلاف ذلك ، حدد موقع الشريحة باستخدام التصوير ثنائي الفوتون (انظر 2.1.5).
   5. قم بالتبديل إلى التصوير ثنائي الفوتون لعرض تعبير المستشعر الحيوي. قم بتشغيل قناتي الكشف للتصوير الفلوري ل eCFP والسترين.
   6. استخدم برنامج الحصول على الصور الذي يتحكم في المجهر ثنائي الفوتون لمسح وتحديد صف من الأطراف المخروطية للتسجيل ( الشكل 3 أ ). اضبط الحصول على الصور على صورة بدقة 128 × 16 بكسل (31.25 هرتز) أو تكوين مشابه. تقييد المنطقة الممسوحة ضوئيا على أطراف مخروطية لتجنب تبييض الأصباغ الضوئية في الأجزاء الخارجية.
      ملاحظة: بالنسبة لمستشعر الكالسيوم TN-XL (τ = ~ 0.6 ثانية ل Ca ^{2 +} ربط ، τ = ~ 0.2 ثانية ل Ca ^{2 +} غير مرتبط) ، يوصى بحد أدنى لمعدل الإطارات ~ 8 هرتز.
   7. تحفيز الضوء وتسجيله
      1. استخدم محفز الضوء كامل المجال للمرحلة الفرعية لتنفيذ الخطوات التالية.
         ملاحظة: الحل البسيط لمحفز الضوء كامل المجال هو استخدام اثنين من مصابيح LED التي تمت تصفيتها بتمرير النطاق ( على سبيل المثال ، "أزرق": 360 تمرير النطاق (BP) 12 ، "الأخضر": 578 BP 10) التي تتطابق مع حساسيات الطول الموجي لمخاريط الماوس ولكن في نفس الوقت لا تتداخل مع المرشحات المستخدمة للكشف عن التألق. يتم تركيز الضوء المنبعث من مصابيح LED بواسطة المكثف من خلال الجزء السفلي من غرفة التسجيل ( الشكل 2 ).
      2. قم بتشغيل الليزر واسمح للمخاريط بالتكيف مع ليزر المسح الضوئي وضوء خلفية التحفيز (20-30 ثانية) قبل تقديم محفزات الضوء (انظر 2.2.3) أو تطبيق العوامل الدوائية.
      3. ابدأ في عرض المحفزات التعسفية ( على سبيل المثال ، ومضات من الضوء ، كما هو موضح في الشكل 3 ب ، ج ). في حالة المحفز الموصوف في الخطوة 2.2.1 ، قم بإنشاء المحفزات عن طريق تعديل شدة مصباحي LED بمرور الوقت باستخدام لوحة معالجات دقيقة يتم التحكم فيها بواسطة برنامج مخصص.
      4. ابدأ في تسجيل قناتي التألق ( على سبيل المثال . ، عند 483 نانومتر ل "blue"
   8. نقل طاقة الرنين Förster (FRET) - eCFP المانح وعند 535 نانومتر لمتقبل FRET "الأصفر") في وقت واحد باستخدام برنامج الحصول على الصور المعني (انظر أيضا 2.1.6). على سبيل المثال ، في حالة ومضات الضوء ( الشكل 3B ، C ) ، سجل ما لا يقل عن 8 - 10 عروض تحفيزية (تجارب).

النتائج

الشكل 1. تحضير شرائح الشبكية العمودية. (أ) شبكية العين المعزولة والمسطحة المعدة للتقطيع. (ب) قطعة مستطيلة من شبكية العين (انظر المربع الأحمر في A) مثبتة على غشاء ورق الترشيح (رمادي غامق) بعد التقطيع. (ج) منظر ...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الشحوم عالية الفراغDow Corning1018817http://www.dowcorning.comغطاء زلاتR. Langenbrinck 24 × 60 مم ؛ http://www.langenbrinck.comشرائح زجاجيةR. Langenbrinck 76 × 26 مم ؛ شفرات http://www.langenbrinck.comلمفرمة المناديلMARTOR KGARGENTAX رقم 10440.25 مم ؛ مفرمة مناديل http://www.martor.de غشاء مرشح النيتروسليلوز المخصص بشبكة Merck Millipore AABG01300 نوع الفلتر: 0.8 ميكرومتر ؛ http://www.emdmillipore.com محفز كامل المجال قائم على LED / الأشعة فوق البنفسجية / الأخضر لوحة معالجات دقيقة مفتوحة المصدرمخصصة Arduino http://www.arduino.ccImaging Software CfNTمكتوبة حسب الطلب تم تطويره بواسطة Michael Müller ، MPI للأبحاث الطبية ، هايدلبرغ ، ألمانياIgorProWavemetrics http://www.wavemetrics.comVC3-4 System Focal نظام الترويةALA أداة علمية مع مشعب طرف قطره 100 ميكرومتر ؛ http://www.alascience.com/ ماي تاي HP DeepSee (Ti: ليزر الياقوت) نيوبورت أطياف الفيزياء http://www.spectra-physics.comمجهر موضوعي متحرك (MOM) ، صممه دبليو دينك ، MPImF ، هايدلبرغ ، ألمانياأدوات سوتر http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.htmlXLUMPlanFL 20x / 0.95w الهدفأوليمبوس http://www.olympusamerica.comلايكا MZ95لايكا http://www.leica-microsystems.com/ الميكروسيستمز