مقالة منهجية

تصوير الخلايا الحية للهجرة النووية الدبقية لمولر أثناء تجديد شبكية الزرد

يونيو 17, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Lahne, M., et.al. استزراع مستخلصات شبكية الزرد البالغة المعدلة وراثيا لتصوير الخلايا الحية بواسطة الفحص المجهري متعدد الفوتونات. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تصوير الخلايا الحية للهجرة النووية الدبقية في مولر في مستخلصات شبكية الزرد المضمنة في الاغاروز بعد تلف المستقبلات الضوئية الناجم عن الضوء. عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) الذي تصدره المستقبلات الضوئية التالفة ينشط خلايا مولر الدبقية ، مما يؤدي إلى الهجرة النووية عبر الطبقات النووية الداخلية والخارجية للانقسام الفتيلي وتوليد السلف العصبي. تكشف الصور الملتقطة عن ديناميكيات الهجرة النووية وتمايز السلف أثناء تجديد الشبكية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوان المناسبة.

1. الفحص المجهري متعدد الفوتون

ملاحظة: تم تحسين التجارب التي أجريت في هذه المخطوطة لمجهر متعدد الفوتون مزود بليزر بالأشعة تحت الحمراء (انظر جدول المواد) ، وهدف الغمر في الماء لمسافات طويلة 40X Apo (NA 1.15) ، وماسح ضوئي للجلفانومتر وغرفة بيئية تحتوي على ملحق لأربعة أطباق بتري مقاس 35 مم. تم الحصول على الصور باستخدام كاشف غير ممسوح ضوئيا (R-NDD).

  1. قبل التصوير ، قم بموازنة الغرفة البيئية لتحقيق 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 / جو الهواء. تأكد من إدخال أطباق بتري الفارغة في الحامل لتجنب تسرب الغاز إلى الغرفة.
  2. قم بتشغيل نظام الفحص المجهري.
  3. بمجرد أن يتم توازن الغرفة البيئية ، أضف سائل معامل الانكسار إلى هدف الغمر في الماء لمسافات طويلة 40X Apo (NA 1.15).
    ملاحظة: يتم استخدام سائل معامل الانكسار ذو الخصائص البصرية المشابهة للماء لتجنب تبخر الماء أثناء التصوير على المدى الطويل.
  4. ضع الفلوروديش مع مستخلصات الشبكية في الغرفة. باستخدام ضوء المجال الساطع ، ضع العينة في مسار الضوء وقم بإحضار المنطقة الوسطى من الشبكية الظهرية إلى مستوى التركيز.
  5. استخدم ضوء الفلورسنت GFP للتركيز على نوى مولر الدبقية الإيجابية ل gfap: nGFP (الشكل 1A ، C).
    ملاحظة: إذا لم يتم تركيب المخططات بشكل مسطح أو تراكمت الاغاروز تحت المصنع ، فسيكون من الصعب التركيز على النوى الموجبة ل gfap: nGFP أو ستتألق بشكل خافت.
    1. تحقق مما إذا كان الانتقال إلى منطقة مختلفة داخل نفس الشبكية سيتغلب على مشكلة التركيز. خلاف ذلك ، انتقل إلى مصنع شبكية مختلف.
  6. في برنامج الحصول على الصور ، افتح نوافذ "واجهة المستخدم الرسومية A1 MP" و "TiPad" و "A1 Compact GUI" و "ACQUISITION ND". للتصوير متعدد الفوتونات، تأكد من اختيار خيار "IR NDD" في "واجهة المستخدم الرسومية المدمجة A1".
  7. في حقل "الإعداد" ، حدد IR-DM للمرآة 1st ثنائية اللون واختر مرشح تمرير النطاق 525/50 للحصول على مضان GFP.
  8. قم بتشغيل ليزر الأشعة تحت الحمراء في النافذة المسماة "A1MP GUI". سوف يستغرق الأمر بضع دقائق حتى يصبح الليزر جاهزا. اضبط الطول الموجي على 910 نانومتر لإثارة مضان GFP ومحاذاة الليزر بالنقر فوق الزر "المحاذاة التلقائية" في نافذة "واجهة المستخدم الرسومية A1 MP".
  9. تأكد من إطفاء أضواء الغرفة والمعدات أو تغطيتها قبل فتح الغالق في "واجهة المستخدم الرسومية A1 MP" لتجنب التعرض المفرط لأنبوب المضاعف الضوئي. لتقليل مستويات الضوضاء ، ضع المجهر في بيئة مظلمة.
  10. احصل على صور لمجال رؤية 300 × 300 بكسل ، بتكبير/تصغير اثنين ، ووقت بقاء بكسل يبلغ 4.8 ميكرو ثانية/بكسل. قم بإعداد طاقة الليزر تقريبا عن طريق تغيير "منطقة الاستحواذ" في "واجهة المستخدم الرسومية A1MP" والكسب في نافذة "واجهة المستخدم الرسومية المدمجة A1".
  11. إعداد z-stack
    1. ركز على طبقة الخلية العقدية (GCL) لتعيين المستوى البؤري العلوي للمكدس z في النافذة الفرعية 'z' داخل نافذة 'اكتساب ND'. توجد بعض الخلايا الإيجابية ل gfap: nGFP عادة في طبقة الخلية العقدية ، مما يساعد على تحديد الحد القاعدي لشبكية العين (الشكل 1 أ ، د).
    2. حرك المستوى البؤري عبر مستوى الطبقة النووية الخارجية (ONL) (الشكل 1 أ ، ب) ، والذي يتميز بوجود خلايا إيجابية gfap: nGFP ذات علامات خافتة مستديرة ومتضخمة بالنسبة لنظيراتها في الطبقة النووية الداخلية (INL) (الشكل 1 أ ، ج).
    3. قم بتعيين هذا المستوى كالجزء السفلي من z-stack. تأكد من تصوير ONL بالكامل (الشكل 1 أ ، ب).
    4. عند مواجهة تحولات المستوى البؤري التي تتطلب إعادة الضبط أثناء فترة التصوير ، انقر نقرا مزدوجا فوق الموضع الأوسط في النافذة الفرعية "z" لتعيينه كموضع "رئيسي". قم بالتغيير إلى "تحديد الوضع المتماثل" وانقر فوق "نسبي".
    5. اضبط حجم الخطوة z بين 0.7 إلى 1 ميكرومتر.
  12. تصحيح شدة Z:
    1. قم بتطبيق تصحيحات كثافة z للتعويض عن فقدان شدة البكسل بسبب تشتت الضوء عند التصوير في طبقات عميقة من الأنسجة.
    2. لإعداد التصحيح، افتح نافذة "تصحيح كثافة z". لتعيين "نطاق z-stack" ، اختر "من ND".
    3. انقر فوق المستوى البؤري السفلي في نافذة "تصحيح شدة z" (في هذه الحالة ، يتوافق مع طبقة الخلية العقدية) واضبط شدة الليزر ("منطقة الاستحواذ" في "واجهة المستخدم الرسومية A1MP") والكسب (واجهة المستخدم الرسومية المدمجة A1).
    4. انقر فوق السهم الموجود بجوار "قيم z" في نافذة "تصحيح شدة z" لتأكيد الإعدادات التي تظهر لاحقا ضمن "إعدادات الجهاز" في نافذة "تصحيح شدة z" للمستوى البؤري المختار.
    5. كرر العملية للطائرات الوسطى والعليا ، مما يزيد من قوة الليزر والكسب. يمكن إضافة مستويات بؤرية إضافية إذا لزم الأمر. انظر الجدول 1 للحصول على إعدادات محددة لليزر والكسب للتجارب في الأشكال 1-3.
    6. اضبط "منطقة الاكتساب" في نافذة "واجهة المستخدم الرسومية (GUI) الإضافية للميجابكسل A1". تجنب تحديد منطقة اكتساب أكبر من 15 وكسب أعلى من 126 في بداية التصوير للتحايل على التبييض الضوئي وزيادة مستويات الضوضاء.
      ملاحظة: نظرا لاختلاف الليزر وأنابيب المضاعف الضوئي بين أنظمة الفحص المجهري ، فقم باختبار الليزر وإعدادات الكسب للحصول على ظروف التصوير المثلى لإعداد المجهر مع تجنب التبييض الضوئي.
    7. اختر "تصحيح الشدة النسبية" في نافذة "تصحيح شدة z".
  13. في النافذة الفرعية "السلاسل الزمنية" في نافذة "اكتساب ND"، اضبط المدة على 8 ساعات والفاصل الزمني على "بدون تأخير". بعد ذلك ، تأكد من النقر فوق "تشغيل تصحيح z" في النافذة الفرعية "z-stack" في زر نافذة "اكتساب ND" للحصول على السلسلة الزمنية ثلاثية الأبعاد.
  14. حافظ على استخلاصات الشبكية عند درجة حرارة 27-29 درجة مئوية طوال مدة الحصول على الصورة.
  15. طوال فترة الحصول على الصورة ، إذا لزم الأمر ، أعد ضبط مستوى الطاقة والكسب من أجل الحفاظ على جودة الصورة لتحليل ما بعد التصوير. بالنسبة للتعديلات، قم بتنفيذ الخطوات 1.11.2 - 1.11.4.
  16. إذا تحول المستوى البؤري ، فقم بإيقاف التشغيل مؤقتا أو إيقافه وتنفيذ الخطوة 1.11 مرة أخرى.
    ملاحظة: إذا تم اختيار "تصحيح z النسبي" في الخطوة 1.12.7 وتم تنفيذ الخطوة 1.11.4 ، فلن يكون من الضروري إعادة ضبط مستويات الطاقة والكسب ، ما لم يحدث تبييض ضوئي واسع النطاق.

الجدول 1: مستويات الليزر والكسب المستخدمة لتصحيحات شدة Z في المستويات المختلفة للتجارب المعروضة في الأشكال 1 - 3.

<فئة الشكل = نمط الجدول = 'float: left ؛ '>< table class = 'ck-table-ressize'> Tg [gfap:EGFP] nt11Tg [rho:Eco.NfsB-EGFP] nt19 طاقة الليزركسبطاقة الليزرأعلى (مستقبلات ضوئية قضيبية) 131263.5118الأوسط (مولر دليبيا) 101262.8118أسفل (طبقة الخلية العقدية) 81262.1118

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

الشكل 1: إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لمداخن Z متعددة الفوتون للشبكية. A) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لسلسلة صور z-stack متعددة الفوتونات من gfap:nGFP- الخلايا الإيجابية في ثقافات الشبكية الكاملة من سمك الزرد بعد 48 ساعة من التلف الضوئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات FluordishWorld precision instrumentsFD35-100 StereomicroscopeNikonSMZ-1Bنوع مماثل من المجهر المجسم التشريح سيعملمصابيح الفلورسنت سيلفانيا OSFP5835HOECOBulbtronics31850 معامل الانكسار السائلCargille Lab1803Y نيكون A1 مجهر متعدد الفوتون مزود بجهاز ليزر مايتاي بالأشعة تحت الحمراء سيعمل نظام نيكون المكافئ40x Apo لهدف الغمر في الماء لمسافات طويلة (NA 1.15) الغرفة البيئية المجهزة بإدراج لنظام Okolab المكافئ مقاس 35 مم سيعملبرنامج تحليل NISنيكون

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TNF alpha GFP Z

مقالات ذات صلة