تصوير بفاصل زمني لخلايا القشرة الدماغية الأولية للفأر المنقولة

الملخص

المصدر: Landeira, B. S.,et al., تصوير حي لخلايا القشرة الدماغية الأولية باستخدام نظام ثقافة ثنائي الأبعاد. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح الفيديو استخدام التصوير بفاصل زمني لتتبع الأسلاف القشرية المصنفة فلورسنت ، ومراقبة انقسامها وتمايزها ، ودراسة تطور النسب في خلايا القشرة الدماغية الأولية

البروتوكول

1. المجهر بالفيديو بفاصل زمني

ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة مجهرا مضوقا مقلوبا مع غرفة حضانة (انظر جدول المواد).

1. بعد الإصابة بالفيروس القهقري ، ضع لوحة زراعة الأنسجة في حاضنة متصلة بوحدات التحكم في درجة الحرارة و CO ₂ .
   ملاحظة: يمكن أن يساعد التسخين المسبق للغرفة لمدة 3 ساعات قبل بدء التصوير في تقليل الانجراف وإلغاء التركيز أثناء الاستحواذ.
   ملاحظة: يجب أن تحافظ الغرفة على الخلايا في ظروف ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
2. حدد موضعا في المحور XY ليكون بمثابة نقطة صفر (XY = 0). سيسمح هذا للإشارة بالعثور على المراكز مرة أخرى في المستقبل.
   ملاحظة: ينصح برسم علامة على اللوحة يمكن استخدامها كمرجع لتحديد نقطة الصفر.
3. حدد المواضع المراد تصويرها بتكبير 10 أضعاف.
   ملاحظة: حدد 10-15 موقعا لكل بئر لزيادة احتمالية مراقبة الخلايا التي يتم نقلها بالفيروسات القهقرية.
   ملاحظة: يمكن استخدام أهداف التكبير العالي لمسافات طويلة (20X أو 40X) للحصول على صور عالية الدقة. اعتمادا على مسافة العمل للأهداف ، قد تكون هناك حاجة إلى ألواح ذات قاع زجاجي.
4. احصل على صور تباين الطور كل 5 دقائق وصور مضان كل 3 ساعات لتقليل السمية الضوئية. تحقق من التركيز واضبطه في أول 3 ساعات من التجربة ، حيث قد يتغير أثناء توازن درجة الحرارة. تحقق من التركيز واضبطه يوميا.
   ملاحظة: نلاحظ أن التركيز يصبح مستقرا بعد أول 24 ساعة. ومع ذلك ، ينصح بمراقبة التركيز. بدلا من ذلك ، استخدم نظام ضبط تلقائي للصورة قائم على البرامج.
5. بعد 7 أيام ، أوقف عملية الاستحواذ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zurich
Cell Observer Microscope	Zeiss
برنامج أداة التتبع (tTt)		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html