$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. تلطيخ الفلورسنت للخلايا العصبية الداخلية الحية
1. انقل شرائح المخيخ باستخدام ماصة باستور زجاجية مقطوعة عريضة التجويف إلى صفيحة من 6 آبار (بحد أقصى 3 شرائح / لكل بئر). استنشق وسط محلول الملح المتوازن (HBSS).
2. احتضان شرائح (3 كحد أقصى) في 5 مل من محلول تحميل صبغة الفلورسنت (10 ميكرومتر).
3. للحماية من الضوء ، قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بورق الألمنيوم. ضعه على طاولة متحركة جيروسكوبية عند 35 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في RT لتسهيل وضع العلامات على الخلايا.
4. نقل الشرائح على غشاء إدراج Transwell (حجم المسام 3.0 ميكرومتر ؛ الشكل 1D ) بماصة باستور زجاجية مقطوعة عريضة التجويف. استنشق وسط التحميل باستخدام الماصة.
5. قم بإزالة الملحق واملأ البئر ب 1.9 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). استبدل الملحق وأضف 100 ميكرولتر من DMEM أعلى الشريحة لتغطية الأنسجة.
6. ضع اللوحة التي تحتوي على إدخالات المزرعة في غرفة الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ) لمدة ساعتين وهو ما يكفي لمراقبة الخلايا الحبيبية (GCs) في الطبقة الجزيئية (ML). استلق الأنسجة بشكل مسطح للسماح بالالتصاق بالغشاء المدخل ( الشكل 1E ). تأكد من عدم جفاف الشرائح.
2. خارج الجسم الحي التصوير من خلال التنظير الماكري متحد البؤر
1. انقل اللوحة بدون الغطاء البلاستيكي إلى حاضنة متصلة بحامل منظار ماكرس متحد البؤر. ضع غطاءا زجاجيا على ملحق اللوحة في المنظار الكبير. حافظ على درجة حرارة الغرفة عند 37.0 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية وقم بتزويد الشرائح بتدفق غاز ثابت (95٪ O 2 ، 5٪ CO 2 }) من خلال ملحق اللوحة للحفاظ على ثبات الأس الهيدروجيني. انتظر لمدة ساعتين إضافيتين قبل تجربة الفاصل الزمني.
2. لتصور هجرة GC في شرائح الأنسجة ، قم بإضاءة المستحضر بضوء بطول موجي 488 نانومتر عن طريق صمام ثنائي ليزر من خلال منظار كبير للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر مزود بهدف جاف X2 (مسافة العمل: 39 مم ، القطر: 58 مم ، NA = 0.234) ، واكتشف انبعاث التألق من 500 إلى 530 نانومتر.
1. لحل حركة GCs بدقة ، احصل على صور بعامل تكبير بصري إضافي من 1.5 إلى 2.0. اجمع صورا ل GCs في مستوى بؤري واحد أو ما يصل إلى 10 مستويات بؤرية مختلفة على طول المحور z كل 30 دقيقة لمدة تصل إلى 12 ساعة.
3. عند الضرورة، قم بإزالة الغطاء الزجاجي وإضافة كميات صغيرة (1-10 ميكرولتر) من المنشطات أو المثبطات البيولوجية في DMEM باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر لدراسة تأثيرها على هجرة GC.
3. تتبع الخلية
1. في كل مرة من الفيلم ، قم بإجراء عرض z-stack من خلال وضع ecart-type في ImageJ. قم بتعديل مستويات التباين والسطوع للصور المتتالية لتسهيل تحديد وتتبع GCs المسماة. قم بتعيين كل موضع يدويا على اللقطة المرجعية (عند t = 0).
1. استخدم المكون الإضافي "التتبع اليدوي" في قائمة تحليل الجسيمات وحدد بالنقر فوق نقطة الجاذبية لكل جسم خلية أثناء الفاصل الزمني. تصدير بيانات التتبع الأولية في جدول بيانات.
2. أعد تنظيم بيانات التتبع الأولية المصدرة من ImageJ باستخدام برنامج منزلي ذكي يحدد كل خلية والمواقف المرتبطة بها. باستخدام البرنامج ، احسب إجمالي المسافة المقطوعة ومتوسط سرعة الهجرة لكل خلية. تصنيف ومقارنة خصائص هجرة الخلايا في ظروف التحكم والعلاج تحت المرشحات المناسبة باستخدام نفس البرنامج.
