مقالة منهجية

التصوير بفاصل زمني لانقسام الخلايا الجذعية العصبية للفأر باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر

يونيو 18, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Daynac, M., et. al. فرز الخلايا للخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية من المنطقة تحت البطينية للفأر البالغ والتصوير الحي لديناميكيات دورة الخلية. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو التصوير بفاصل زمني للخلايا الجذعية العصبية (NSCs) من دماغ فأر معدل وراثيا باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤر. تتألق الخلايا العصبية العصبية باللون الأحمر خلال المرحلة G1 وتكون غير فلورية في مراحل دورة الخلية الأخرى. يتم وضع ثقافة NSC ملتصقة في غرفة التصوير ، ويتم تعيين معلمات التصوير ، ويتم التقاط الصور على فترات منتظمة للمدة المطلوبة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الإعداد الأساسي قبل الثقافة وفحص الفيديو المجهري

  1. استخدم ألواح ثقافة ذات قاع زجاجي أو ألواح μ للفحص المجهري بالفيديو متحد البؤر. بالنسبة للبئر من 1 إلى 5 × 103 خلايا / بئر ، استخدم ألواح 96 بئرا ، ولأكثر من 5 × 103 خلايا / بئر ، استخدم ألواح 24 بئرا.
  2. قبل يوم واحد على الأقل من بدء التجربة ، قم بإعداد ألواح مطلية ب Poly-D-lysine (PDL) معقمة للثقافات أحادية الطبقة الملتصقة. أضف ما يكفي من PDL (10 ميكروغرام / مل في الماء المقطر أو dH2O) لتغطية قاع كل بئر واحتضانه طوال الليل (O / N) عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة محلول PDL واشطفه ثلاث مرات باستخدام dH2O قبل السماح للوحة بالجفاف في الغطاء خلال ساعتين على الأقل تحت تدفق رقائقي. إذا لم يتم استخدامه على الفور ، قم بتخزين اللوحة المطلية عند -20 درجة مئوية.
  3. تحضير وسط الاستزراع عن طريق خلط الوسط القاعدي للخلايا الجذعية العصبية (NSC) ومكمل تكاثر الخلايا الجذعية العصبية بنسبة 9: 1 (انظر جدول المواد) جنبا إلى جنب مع 2 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة المؤتلف البشري المنقى (EGF) ، و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية المؤتلفة البشرية 2 (FGF-2). قم بتسخين وسط المزرعة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل الاستخدام.
  4. لتفكك المنطقة تحت البطينية (SVZ) ، قم بإعداد محلول غراء: 1 مجم / مل غراء (15 UI / مل) في محلول ملح إيرل بالانس (EBSS) يحتوي على 0.2 مجم / مل L-cysteine ، و 0.2 مجم / مل من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، و 0.01 مجم / مل DNase I في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). عقم المحلول عن طريق تمريره عبر مرشح 0.2 ميكرومتر. قم بموازنة المحلول عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  5. لإيقاف التفاعل الأنزيمي ، قم بإعداد محلول مثبط للبروتياز (Ovomucoid): وسط النسر المعدل من dulbecco (DMEM): وسط F12 يحتوي على 0.7 مجم / مل مثبط التربسين من النوع الثاني. قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر.
  6. قم بإعداد محلول الجلوكوز PBS 0.6٪ لجمع الأدمغة ومحلول ألبومين مصل الأبقار PBS 0.15٪ (BSA) لخطوات الغسيل وتلوين الأجسام المضادة.
  7. تحضير أدوات التشريح: المقص ، ملقط التشريح والربط ، ومشرط. نقعها في 70٪ من الإيثانول.

2. حصاد أدمغة الفئران البالغة والتشريح المجهري SVZ

  1. التضحية بالفئران البالغة (من 2 إلى 3 أشهر و / أو 12 شهرا لدراسات الشيخوخة) ، وإجراء خلع عنق الرحم وفقا للإرشادات المؤسسية المناسبة.
  2. رش الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول واقطع الرأس باستخدام مقص حاد.
  3. قم بعمل شق على طول فروة الرأس للكشف عن الجمجمة.
  4. قم بإجراء قطع خط الوسط الطولي بدءا من قاعدة الجمجمة باتجاه المصابيح الشمية باستخدام مقص صغير. تأكد من تجنب إتلاف الدماغ الأساسي باستخدام شفرات المقص. قم بإزالة الجزء العلوي المفتوح من الجمجمة باستخدام ملقط منحني لفضح الدماغ.
  5. اجمع الدماغ في طبق بتري مقاس 15 مم يحتوي على 0.6٪ جلوكوز في PBS.
  6. قم بتشريح المصابيح الشمية. ضع الدماغ على سطحه الظهري وقم بعمل قسم إكليلي من خلال التصلب البصري باستخدام مشرط.
  7. تحت مجهر تشريح ، ضع الجزء المنقاري من قسم الدماغ بحيث يكون السطح الإكليلي المقطوع متجها لأعلى باتجاه المجري.
  8. لتشريح SVZ ، قم بإزالة الحاجز باستخدام ملقط منحني ناعم ، ثم أدخل طرفا واحدا من ملقط ناعم في المخطط المجاور للبطين مباشرة وافصل SVZ عن الأنسجة المحيطة. ضع SVZ المفصل في طبق بتري يحتوي على 1 مل من PBS-0.6٪ جلوكوز.

3. تفكك الأنسجة SVZ

  1. افرم SVZ المقطعة في طبق بتري حتى تختفي القطع الكبيرة.
  2. انقل الأنسجة المفرومة مع PBS-0.6٪ جلوكوز إلى أنبوب 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  3. تخلص من المادة الطافية وأضف 1 مل من غراء مسخن مسبقا (1 مجم / مل ، محضر في الخطوة 1.4) مكمل ب 0.01 مجم / مل DNase I. احتضن لمدة 10 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. استخدم 1 مل من غراء لكل فأر.
  4. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  5. أضف 1 مل من البويضات المسخنة مسبقا (0.7 مجم / مل ، المحضرة في الخطوة 1.5) لإيقاف نشاط غراء. قم بفصل الأنسجة المفرومة ميكانيكيا إلى معلق أحادي الخلية عن طريق سحب الأنسجة برفق لأعلى ولأسفل 20 مرة من خلال طرف ماصة دقيقة p1000. تجنب فقاعات الهواء.
  6. مرر معلق الخلية من خلال مرشح معقم 20 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 15 مل. تأكد من غسل مرشح الخلية باستخدام PBS 0.15٪ BSA لتجنب فقدان الخلايا.
  7. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على 0.15٪ BSA.

4. تلطيخ الفلورسنت المناعي لفرز الخلايا

لفرز الخلايا باستخدام الفئران FUCCI-Red (الشكل 1 أ) ، استخدم الأجسام المضادة التالية: CD24 phycoerythrin-cyanine7 المترافق [PC7] ؛ CD15 / LeX فلوريسين إيزوثيوسيانات [FITC] مترافق و Ax647 مترافق EGF ligand.

ملاحظة: خلايا LeX + EGFR + وخلايا EGFR + ليست وفيرة في SVZ البالغ: ≈ 600 و 1500 خلية / فأر ، على التوالي. نوصي بتجميع خلايا SVZ من 2 إلى 3 فئران للحصول على مادة كافية. لا تعمل مع أكثر من 12 فأرا في نفس اليوم بحيث لا تتجاوز مدة فرز الخلايا 3 ساعات. ضع في اعتبارك أن العمل مع عدد كبير جدا من الفئران في نفس اليوم سيؤدي إلى زيادة مدة فرز الخلايا ، مما قد يؤدي إلى زيادة موت الخلايا و / أو تمايز الخلايا.

  1. قم بإجراء تلطيخ FACS في 100 ميكرولتر من PBS 0.15٪ BSA لكل فأر (أو في 200 ميكرولتر لمجموعة من 2 إلى 3 فئران للحصول على تلطيخ مثالي).
  2. تحضير أنابيب التحكم. استخدم حبات التعويض لإعداد أنابيب تحكم أحادية اللون وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. حدد جزءا من الخلايا (1/10 من الخلايا المستخرجة من فأر واحد كافية) وافصلها إلى 4 أنابيب لإعداد أنبوب تحكم سلبي واحد (خلايا غير مميزة) و 3 أنابيب تحكم مضان ناقص واحد (FMO). إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS 0.15٪ BSA لكل أنبوب.
    تلميح: للتحكم في LeX-FITC FMO ، قم بتسمية الخلايا ب CD24-PC7 (1:50) و Ax647 ‐ ترابط EGF المترافق (1: 200) ؛ للتحكم في CD24-PC7 FMO ، قم بتسمية الخلايا ب CD15 / LeX-FITC (1:50) و Ax647 ‐ ترابط EGF المترافق (1: 200) وللتحكم في ترابط EGF المترافق Ax647 ، قم بتسمية الخلايا ب CD15 / LeX-FITC (1:50) و CD24-PC7 (1:50).
  3. بالنسبة للأنابيب المستخدمة لفرز الخلايا ، استخدم الأجسام المضادة التالية عند التخفيف المشار إليه في PBS 0.15٪ BSA: CD24-PC7 (1:50) ، CD15 / LeX-FITC (1:50) ، و Ax647 ‐ ترابط EGF المترافق (1: 200).
  4. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام. يغسل ب 1 مل PBS 0.15٪ BSA وجهاز طرد مركزي بوزن 200 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS 0.15٪ BSA لكل دماغ. احتفظ بأنابيب فرز الخلايا على الجليد وانتقل على الفور إلى فرز الخلايا.
  5. في حالة استخدام الفئران FUCCI-Green ، افصل بين الكسور الموجبة LeX والسالبة LeX باستخدام أعمدة الفصل قبل فرز الخلايا ، حيث يشترك الجسم المضاد LeX-FITC في نفس الطول الموجي للانبعاث مثل التألق الأخضر FUCCI (الشكل 2 أ ، ب).
    1. أولا، قم بتسمية الخلايا بجسم LeX مضاد للإنسان (1:50) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام في 100 ميكرولتر من PBS 0.15٪ BSA.
    2. اغسل الخلايا ب 1 مل PBS 0.15٪ BSA وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتسمية الخلايا بميكروبيدات IgM المضادة للفأر (1:10) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
    3. اغسل الخلايا ب 1 مل PBS 0.15٪ BSA وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر PBS 0.15٪ BSA واسكب الخلايا من خلال عمود الفصل في المجال المغناطيسي كما هو مخطط في الشكل 2C. اغسل العمود ب 1 مل PBS 0.15٪ BSA للحصول على الكسر السالب LeX.
    4. للحصول على كسر موجب LeX ، قم بإزالة عمود الفصل من المجال المغناطيسي وقم بإزالة الخلايا ب 2 مل PBS 0.15٪ BSA.
    5. انتقل إلى تلطيخ ترابط EGF المترافق CD24-PC7 و Ax647 كما هو موضح في 4.2.

5. ملاحظة فرز الخلايا

: تم فرز الخلايا على فارز FACS عند 40 رطل لكل بوصة مربعة بفوهة 86 ميكرومتر. تم جمع التألق باستخدام مجموعة المرشحات التالية: 520/35 نانومتر (FITC) و 575/26 نانومتر (PE) و 670/20 نانومتر (Ax647) و 740LP (PC7). التعويض ضروري لمنع الإشارات الإيجابية الكاذبة حيث يوجد تداخل بين أطياف الانبعاث للتألق الأحمر FUCCI وصبغة PC7.

  1. مباشرة قبل فرز الخلايا ، أضف صبغة حيوية للتمييز بين الخلايا الحية والميتة. استخدمنا Hoechst (HO) (انظر جدول المواد) بتركيز نهائي 2 ميكروغرام / مل. قم بتشغيل أنبوب التحكم السالب (الخلايا غير المميزة) من خلال فارز FACS وحدد الخلايا باستخدام معلمات التشتت الجانبي (SSC) والمبعثر الأمامي (FSC) (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: تم استبعاد الخلايا الميتة عن طريق بوابات الكسر السالب HO فقط (الشكل 3 أ) ، ثم تم استبعاد الزوجيات عن طريق تحديد الكسر السالب لعرض النبضة (الشكل 3 أ).
  2. قم بتشغيل عناصر التحكم أحادية اللون المعدة في الخطوة 4.2 واضبط جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) إذا لزم الأمر (أي عدد السكان السلبي مرتفع جدا و / أو الخلايا الموجبة خارج المقياس). قم بإجراء تعويض اللون في نافذة التعويض الخاصة بالبرنامج.
  3. قم بتشغيل عناصر تحكم FMO المعدة في الخطوة 4.2 (التحكم في LeX-FITC FMO ، والتحكم CD24-PC7 FMO ، والتحكم في ترابط EGF المترافق Ax647) ورسم بوابات الفرز (الشكل 3). قم بفرز الخلايا مباشرة إلى 100 ميكرولتر من وسط المزرعة في أنابيب دقيقة سعة 1.5 مل.

6. تحضير الخلايا للفحص المجهري

  1. ، والخلايا التي تم فرزها حديثا بكثافة 1 - 3 × 103 خلايا / بئر على لوحة μ 96 بئر مطلية ب Poly-D-Lysine مع 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع.
  2. قبل الفحص المجهري بالفيديو ، احتضان ألواح الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح بالتصاق الخلية.

7. إعداد المجهر والحصول على

  1. الصور قم بإجراء التصوير المباشر باستخدام هدف Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) على نظام مجهر مسح ضوئي بالليزر متحد البؤر متصل بغرفة مقلوبة بالحرارة عند 37 درجة مئوية تحت جو ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
  2. ضع اللوحة μ التي تحتوي على 96 بئرا داخل الغرفة الحرارية الدافئة مسبقا والمتوازنة واستبدل الغطاء بغطاء بالحرارة.
  3. افتح برنامج NIS-Elements وانقر في شريط القائمة على "اكتساب / ضوابط الاستحواذ / اكتساب ND" لتحديد خيارات الفاصل الزمني (الطول ، مواضع المرحلة ، الأقسام z متحد البؤر,...) ، "عناصر التحكم في الاستحواذ / الاستحواذ / Ti Pad" لتحديد الأهداف و "عناصر التحكم في الاستحواذ / الاستحواذ / إعدادات A1plus" لتحديد مستوى PMT لكل تألق في شريط القائمة. حدد مجلدا لحفظ ملفات البيانات.
  4. باستخدام نافذة اكتساب ND ، اضبط مركز كل بئر كموضع المرحلة وحدد خيار الصورة الكبيرة على 7 × 7 مم². سيؤدي ذلك إلى إنشاء صورة فسيفساء حول مركز كل بئر. اضبط التداخل لصورة الفسيفساء الكبيرة على 5٪. التقط صورا كل 20 دقيقة لمدة 24 ساعة. حدد هدف Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) في نافذة Ti Pad.
  5. في نافذة إعدادات A1plus ، احصل على صور باستخدام ماسح ضوئي رنين عالي السرعة بتنسيق 512 × 512 بكسل بدقة 1.26 ميكرومتر / بكسل. استخدم brightfield لتصور أشكال الخلايا. في حالة الفئران FUCCI-Red ، قم بإثارة التألق الأحمر عند 561 نانومتر وجمعها باستخدام مرشح 595/50 نانومتر. في حالة الفئران FUCCI-Green ، قم بإثارة التألق الأخضر عند 488 نانومتر وجمعها باستخدام مرشح 530/40 نانومتر. حدد مستوى PMT الأمثل والإزاحة وطاقة الليزر لكل طول موجي.
    ملاحظة: نوصي باستخدام وظيفة التركيز البؤري التلقائي لقناة المجال الساطع للسماح للبرنامج بالتركيز التلقائي في كل موضع مرحلة قبل كل عملية اكتساء. تلميح: تم استخدام هدف Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) لدقته الممتازة دون الحاجة إلى النفط. يمكن استخدام أهداف أخرى اعتمادا على الدقة البصرية المطلوبة.
  6. حدد الزر "تشغيل الآن" في نافذة الاستحواذ على ND لبدء الاستحواذ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة الشكل = 'image image-style-align-center image_resized' style = 'display: table ؛ margin-left: auto ؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>figure-results-1

الشكل 1: تحليلات حية لدورة الخلية باستخدام فئران FUCCI-Red. (أ) التمثيل التخطيطي لدورة الخلية FUCCI-Red ، حيث تكون الخلايا فلورية حمراء خلال G1 مرحلة وعديمة اللون خلال مراحل SG2 / M. (ب) تمثيل FACS لمض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 جيدا من ألواح الثقافة الزجاجية غير المطليةMatTek Corp.P96G-1.5-5-F μ-Plates 96-wellIbidi89626 Poly-D-LysineMilliporeA003E NeuroCult NSC Basal MediumSTEMCELL Technologies5700 NeuroCult NSC ProliferationSupplement STEMCELL Technologies5701 HeparinSTEMCELL تكنولوجيز7980 EGFMilliporeGF144 FGF-2MilliporeGF003 PapainWorthingtonLS003119 EBSSInvitrogen24010-043 L-cysteineSigmaC-7352 0.5M EDTA ، درجة الحموضة 8.0PromegaV4231 DNase ISigmaD5025-15KU مثبط التربسين من النوع الثانيSigmaT9128OvomucoidDMEM: F12 تقنيات العمر المتوسط31330-038 مرشح 20 ميكرومترBD Medimachine Filcon340622 Eppendorf microtubes 3810XSigmaZ606340-1000EA BSASigmaA1595محلول ألبومين مصل الأبقارCD24 مترافق phycoerythrin-cyanine7 [PC7] Life TechnologiesA14776Mouse IgM ؛ استنساخ MMA. 1:50CD15 / LeX فلوريسين إيزوثيوسيانات [FITC] - BD Biosciencesالمترافق 332778Rat IgG2b ؛ استنساخ M1 / 69. 1:50الفأر المضاد للجسم المضاد LeX للإنسانBD Pharmingen559045Mouse IgM ؛ استنساخ MAM. 1:50Alexa647 - مترافق EGF ligandLife TechnologiesE353511: 200 ؛ Ax647 مترافق EGFligand CompBeadsBD Biosciences644204 MACS LS أعمدة الفصلMiltenyi Biotec130-042-401أعمدة الفصلالميكروبيدات IgM المضادة للفأرMiltenyi Biotec130-047-301 Hoechst 33258Sigma861405 فارز الخلايا INFLUXBD Biosciences فارز FACSنظام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر نيكون A1R متصل بشركة ECLIPSE TiNikon Corp المقلوبة. مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرNIS-Elements AR.4.13.01 برنامج 64 بتشركة نيكون خطة برنامج NIS-ElementsApo VC 20x DIC الهدف (NA: 0.75) شركة نيكون. غرفة ECLIPSE Ti بالحرارة شركة نيكون كورب. غرفة حراريةImageJRBS FlowJoTree Star ، Ashland ، أو FUCCI للفئرانRIKEN BioResource Center ، اليابان

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Neural Stem CellsCell Cycle DynamicsFluorescent TaggingG1 PhaseHigh Speed Resonant ScannerTemperature Control ChamberFluorescence IntensityImage Acquisition

مقالات ذات صلة