تصوير الكالسيوم بالمنظار المجهري في الوقت الحقيقي في فأر يتحرك بحرية

الملخص

المصدر: Lee, H. et. al. ، تصوير الكالسيوم الناجح في الجسم الحي باستخدام مجهر مصغر على الرأس في اللوزة الدماغية للفأر الذي يتصرف بحرية. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في الماوس باستخدام معامل الانكسار المتدرج ، أو عدسة GRIN ، ومجهر مصغر. يجمع الإعداد بين تثبيت الرأس داخل نظام قفص متحرك عديم الاحتكاك ، مما يحفز الخلايا العصبية ويؤدي إلى تدفق أيونات الكالسيوم. تلتقط عدسة GRIN إشارات الكالسيوم في الدماغ ، مما يتيح التصور في الوقت الفعلي للنشاط العصبي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

ملاحظة: يتكون هذا البروتوكول من ست خطوات رئيسية: جراحة حقن الفيروس ، وجراحة زرع عدسة معامل الانكسار المتدرج (GRIN) ، والتحقق من صحة زرع عدسة GRIN ، ومرفق الصفيحة الأساسية ، والتسجيل البصري ل GCaMP (اندماج بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، والكالمودولين (CaM) ، و M13 ، تسلسل الببتيد من كيناز السلسلة الخفيفة للميوسين أثناء اختبار السلوك ، ومعالجة البيانات (الشكل 1 أ). باستثناء الجراحة ، يتم استخدام حزمة البرامج التجارية (Inscopix).

1. الجراحة التجسيمية - حقن الفيروس المرتبط بالغدة (AAV)
ملاحظة: سلالة الفأر المستخدمة في هذا الإجراء الجراحي هي C57BL6 / J. يتم تغطية جسم بستارة معقمة أثناء الجراحة ، ويتم تنفيذ جميع خطوات البروتوكول مع ارتداء قفازات معقمة. عادة لا يتم إجراء عمليات جراحية متعددة في نفس اليوم. ومع ذلك ، إذا كان على العديد من الفئران إجراء نفس الجراحة في نفس اليوم ، فاستخدم مجموعة منفصلة من الأدوات الجراحية المعقمة لكل فأر و 70٪ من الإيثانول لتطهير الأدوات الجراحية بين الفئران. للحفاظ على دفء الماوس أثناء العملية الجراحية ، يتم تغطية الفأر ببطانية جراحية مصنوعة خصيصا بعد تثبيته على الإطار التجسيمي.

1. قم بتطهير جميع الأدوات الجراحية المطلوبة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بإعداد حقنة هاميلتون وماصة زجاجية. املأ الماصة الزجاجية بالماء المقطر.
   ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات الجراحية المستخدمة في البروتوكول. نظرا لأنه لا يمكن تعقيم عدسة GRIN ومسامير الجمجمة للتعقيم ، يتم استخدام 70٪ من الإيثانول كمطهر لمنع الالتهاب. على الرغم من عدم تجربتها ، يمكن استخدام أشكال أخرى من التعقيم مثل التعقيم بالغاز أو الكيميائي.
2. تخدير الفأر بالبنتوباربيتال (83 مجم ∙ كجم -1 من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. بعد أن يفقد الفأر الوعي ، احلق الفراء على الجمجمة.
3. نظف الجلد فوق الجمجمة بنسبة 70٪ من الإيثانول وثبت الماوس على الإطار التجسيمي. قم بإزالة الجلد بعناية وامسح سطح الجمجمة بمحلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 35٪ باستخدام قضيب قطني. ضع مرهم العين المزيق لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة.
   ملاحظة: على الرغم من عدم وجود مشكلة في استخدام 70٪ من الإيثانول فقط لتحضير الجلد المعقم ، فمن المستحسن استخدام 3 جولات متناوبة من المطهر مثل اليودوفور أو محلول الكلورهيكسيدين ، و 70٪ إيثانول. يتم استخدام تركيز أعلى من بيروكسيد الهيدروجين في هذا البروتوكول للتأكد من إزالة النسيج الضام على جمجمة الفأر بأكبر قدر ممكن من الاكتمال ، وهو أمر بالغ الأهمية لتقليل القطع الأثرية للحركة أثناء التصوير اللاحق لأن النسيج الضام على الجمجمة يتداخل مع ارتباط ثابت للصفيحة الأساسية بالجمجمة. وتجدر الإشارة إلى أن بيروكسيد الهيدروجين 35٪ أعلى بكثير مما يستخدم عادة (3٪).
4. قم بإصلاح الدبوس باستخدام حامل مسبار تجسيم. قم بمحاذاة ارتفاع البريغما واللامدا مع الدبوس.
5. ابحث عن الموقع المحدد على جمجمة الفأر لبضع القحف.
   ملاحظة: إحداثيات اللوزة الجانبية (LA) لحقن الفيروس هي (AP ، ML ، DV) = (-1.6 مم ، -3.5 مم ، -4.3 مم) من بريجما في هذا البروتوكول (AP ؛ الأمامي الخلفي ، ML ؛ الإنسي الجانبي ، DV ؛ ظهري بطني ، يشير كل اختصار إلى المسافة المحورية النسبية من البرجما). يجب تحسين الإحداثيات لكل حالة تجريبية.
6. حفر سطح الجمجمة (الشكل 1 ب). اغسل أجزاء الجمجمة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). قم بإزالة الطبقة المتبقية باستخدام ملقط أو إبرة 27 جرام.
   1. عند حفر الجمجمة، حاول ألا تلمس طبقة الجافية الأخيرة لتجنب إتلاف سطح أنسجة المخ. يتسبب سطح الدماغ التالف في حدوث التهاب حول العدسة ، مما يؤدي إلى قطع أثرية شديدة للحركة وارتفاع التألق الذاتي أثناء التسجيل. حج القحف 1.6 ملم. سرعة الحفر 18,000 دورة في الدقيقة ، وحجم البت 0.6 مم.
7. لخفض عدسة GRIN من سطح أنسجة المخ في الموقع المحفور إلى موقع اللوزة المستهدفة ، احسب المسافة المسماة باسم "القيمة A" عن طريق طرح فرق DV بين البريجما وسطح الدماغ المكشوف من إحداثيات DV لزرع العدسة ، والتي يتم ضبطها بناء على البريجما (4.2 مم في هذه الحالة ، الشكل 1 ج).
8. قم بتحميل 3 ميكرولتر من الزيت المعدني و 0.7 ميكرولتر من محلول فيروس AAV في الماصة الزجاجية.
   ملاحظة: يساعد الزيت المعدني على فصل محلول الفيروس عن الماء. 0.7 ميكرولتر هو حجم محسن لحقن فيروس LA الذي يمكنه تغطية LAV بالكامل.
9. قم بإزالة الدبوس من حامل المسبار التجسيمي وقم بتثبيت الماصة الزجاجية به.
10. حدد موقع الماصة الزجاجية في موقع الحقن المذكور في الخطوة 1.5. أدخل الماصة الزجاجية في أنسجة المخ بعد إيقاف النزيف تماما.
11. قم بتوصيل الفيروس من خلال ماصة زجاجية باستخدام مضخة حقن.
    ملاحظة: يجب أن يكون عيار الفيروس أعلى من 1 × 1013 vg / مل للحصول على عدد كاف من الخلايا الشفرة عن GCaMP. سرعة الحقن 0.1 ميكرولتر / دقيقة وتنتشر لمدة 10 دقائق. إذا كان هناك نزيف ، اغسل سطح الدماغ باستخدام PBS. حافظ على سطح الدماغ رطبا في هذه الخطوة.
12. بعد الانتهاء من الحقن ، قم بإزالة الماصة الزجاجية ببطء.

2. الجراحة التجسيمية - زرع عدسة GRIN
ملاحظة: جراحة زرع عدسة GRIN هي الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. نظرا لأن السرعة البطيئة المتسقة لحركة عدسة GRIN أمر بالغ الأهمية لنجاح زرع عدسة GRIN ، يمكن أن يكون ذراع الجراحة الآلية مفيدا. ذراع الجراحة الآلية عبارة عن مناور تجسيمي يتم التحكم فيه بواسطة برامج الكمبيوتر. على الرغم من استخدام الذراع الآلية في هذا البروتوكول ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام طرق أخرى طالما أن العدسة تتحرك باستمرار وببطء أثناء الزرع. توجد معلومات مفصلة حول الجهاز في جدول المواد.

1. حفر الجمجمة لزرع اثنين من المسمار. اغسل جميع كسور الجمجمة باستخدام PBS.
   NOTE: لتقليل القطع الأثرية للحركة في التصوير البصري اللاحق ، يلزم وجود مسمارين على الأقل. يشكل مسامير الجمجمة وموضع زرع عدسة GRIN مثلثا متساوي الأضلاع (الشكل 1 ب). يجب أن يتناسب حجم حج القحف بإحكام مع قطر المسمار. إذا كان هناك نزيف ، اغسل سطح النزيف باستخدام PBS. سرعة الحفر 18,000 دورة في الدقيقة ، وحجم البت 0.6 مم.
2. تطهير البراغي ب 70٪ إيثانول لمنع الالتهاب. زرع البراغي بعمق قدر الإمكان.
   ملاحظة: يجب تثبيت البراغي بإحكام دون التصاق إضافي ، مثل الأسمنت.
3. قم بتثبيت ذراع الجراحة الآلية على الإطار التجسيمي. قم بتوصيل الأجهزة المطلوبة بالكمبيوتر المحمول الذي تم تثبيت برنامج التحكم فيه (جدول المواد).
4. قبل خفض عدسة GRIN ، استعد لعمل مسار إبرة بإبرة 26 جراما.
   ملاحظة: مسار الإبرة هو نوع من المسار الإرشادي الذي يساعد على زرع عدسة GRIN السميكة نسبيا في مناطق الدماغ العميقة مثل اللوزة دون التسبب في تشويه شديد في بنية الدماغ على طول مسار الحقن. يسمى مسار التوجيه هذا بمسار الإبرة لأنه يتم إجراؤه عن طريق إجراء خفض ورفع لإبرة رفيعة نسبيا 26 جراما.
5. قم بتوصيل حامل القنية لتثبيت الإبرة بثبات على الإطار التجسيمي.
6. أمسك الإبرة 26 جم بحامل القنية واحسب إحداثيات موقع إدخال الإبرة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تكون إحداثيات موقع إدخال الإبرة على بعد 50 ميكرومتر جانبيا من موقع حقن الفيروس (AP ، ML ، DV) = (-1.6 مم ، -3.55 مم ، -3.7 مم).
7. قم بالوصول إلى برنامج التحكم والتحضير الكامل لمعالجة موضع الإبرة.
   1. قم بتشغيل برنامج التحكم وحدد الزر بدء مشروع جديد لبدء جلسة التحكم.
      ملاحظة: في جلسة التحكم، هناك العديد من المربعات الفارغة وأزرار القائمة. المربعات الفارغة هي مساحات إدخال للإحداثيات. بعد إدخال الإحداثيات في المربعات الفارغة ، يتحرك الذراع التجسيمي الآلي بالنقر فوق الزر "انتقال". يتغير الزر Go To إلى زر STOP عندما يتحرك الذراع التجسيمي. من بين العديد من أزرار القائمة ، مطلوب زر الأداة فقط في هذا البروتوكول.
   2. انقر فوق الزر "أداة". قم بمعايرة برنامج التحكم بالنقر فوق الزر معايرة قائمة الإطار. المعايرة هي العملية التي يتم من خلالها تعيين الموضع الفعلي للمناور كقيم على برنامج Stereodrive.
8. حدد موقع طرف الإبرة على سطح الدماغ المكشوف على سطح الجمجمة باستخدام مناور تجسيم.
   ملاحظة: يتم ضبط سرعة الإبرة باستخدام قائمة سرعة Microdrive في قائمة الأداة. السرعة الافتراضية هي 3.0 مم / ثانية. ومع ذلك ، يوصى بسرعة 0.5 مم / ثانية في هذه الخطوة. يتم التحكم في حركة الإبرة بواسطة مفاتيح الأسهم.
9. أضف 2-3 قطرات من PBS للحفاظ على سطح الدماغ رطبا. املأ المربع الفارغ على شاشة الكمبيوتر بإحداثيات DV المناسبة ل LA. إذا كان سطح الدماغ جافا ، فإنه يعيق تغلغل الإبرة في أنسجة المخ.
10. اخفض الإبرة 26 جيجا بالنقر فوق الزر "انتقال". يتوقف تلقائيا عندما تصل الإبرة إلى الموقع المستهدف الذي حددته إحداثيات DV. سرعة الإبرة 100 ميكرومتر / دقيقة. إذا كان هناك نزيف ، أوقف الإبرة بالنقر فوق الزر STOP واغسل سطح الدماغ باستخدام PBS. حافظ على سطح الدماغ رطبا في هذه الخطوة. بعد توقف النزيف ، ابدأ في الخفض مرة أخرى.
11. بعد أن تتوقف الإبرة عن الحركة تماما ، أدخل 45.00 مم في المربع الفارغ على شاشة الكمبيوتر.
    ملاحظة: 45.00 مم هي قيمة إحداثيات DV التي تجعل الإبرة تعود إلى وضع البداية.
12. ارفع الإبرة بالنقر فوق الزر "انتقال". سرعة حركة الإبرة 100-200 ميكرومتر / دقيقة.
13. بعد أن تتوقف الإبرة عن الحركة ، قم بإزالة PBS على سطح الدماغ. قم بإلغاء تثبيت حامل الإبرة والقنية من الإطار التجسيمي. يمكن للمجرب إيقاف الإبرة يدويا عن طريق النقر فوق الزر STOP عند الضرورة.
14. قم بتجهيز قضيب التجسيم بحامل العدسة. قم بتثبيت عدسة GRIN على حامل العدسة.
    ملاحظة: يتم استخدام عدسة GRIN المحسنة لاستهداف LA (قطرها 0.6 مم وطول 7.3 مم) في هذا البروتوكول. إذا لم يكن حامل العدسة مستعدا ، فإن الطريقة البديلة هي استخدام مشبك البلدغ لإمساك عدسة GRIN.
15. قم بتطهير العدسة بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتوصيل قضيب التجسيم بالإطارات التجسيمية.
16. حدد موقع طرف عدسة GRIN في الموقع المحدد على سطح الجمجمة (نفس الطريقة الموضحة في الخطوة 2.8).
    ملاحظة: إحداثيات عدسة GRIN هي (AP ، ML ، DV) = (-1.6 مم ، -3.55 مم ، -4.2 مم) (الشكل 1C). يجب ألا تلمس العدسة الجمجمة لتجنب تلف طرفها.
17. احسب إحداثيات القيمة اليومية عن طريق طرح القيمة المطلقة ل "القيمة A" من إحداثيات DV لزرع العدسة الموضحة في الخطوة 2.16.
18. قم بإسقاط 2-3 قطرات من PBS على سطح الدماغ. أدخل 1000 ميكرومتر للخفض و 300 ميكرومتر لرفع العدسة في المربع الفارغ على شاشة الكمبيوتر.
19. كرر خفض عدسة GRIN (1000 ميكرومتر لأسفل) ورفعها (300 ميكرومتر لأعلى) حتى تصل إلى الموقع المستهدف. يستخدم هذا الإجراء لأعلى ولأسفل للمساعدة في تحرير الضغط المتولد داخل أنسجة المخ بسبب إجراء خفض العدسة الذي يمكن أن يتسبب في تشويه هياكل الدماغ على طول مسار الزرع.
    ملاحظة: تبلغ سرعة حركة عدسة GRIN 100 ميكرومتر / دقيقة. حتى لو كان هناك نزيف ، فلا تتوقف عن تحريك عدسة GRIN واغسل سطح الدماغ باستخدام PBS. حافظ على سطح الدماغ رطبا في هذه الخطوة. إذا كان سطح الدماغ جافا ، تلتصق أنسجة المخ بسطح عدسة GRIN وتسبب تشويها في بنية الدماغ.
20. إذا وصلت عدسة GRIN إلى الموقع المستهدف ، فقم بإزالة PBS وقم بتطبيق الأسمنت السني الراتنجي بعناية حول عدسة GRIN والبراغي والجدار الجانبي (الشكل 1D).
    ملاحظة: قد يؤدي وضع الأسمنت الراتنجي في جميع أنحاء الجمجمة إلى تقليل القطع الأثرية للحركة. على العكس من ذلك ، إذا كان الأسمنت الراتنجي يغطي العضلات المرتبطة بالجمجمة عن طريق الخطأ ، فإنه يزيد من القطع الأثرية للحركة.
21. بعد أن يصلب أسمنت الأسنان الراتنجي ، قم بتفكيك عدسة GRIN من حامل العدسة وقم بتطبيق الأسمنت الأكريليكي في جميع أنحاء الجمجمة (الشكل 1 د).
22. لتوصيل لوحة الرأس ، قم بتفكيك حامل العدسة من قضيب التجسيم وقم بتوصيل لوحة الرأس على طرف القضيب باستخدام الأشرطة. تأكد مما إذا كانت لوحة الرأس أفقية.
    ملاحظة: تتسبب لوحة الرأس المائلة في إمالة الرؤية. مطلوب لوحة رأس لتثبيت رأس الماوس في نظام قفص المنزل المتنقل (في قسم مرفق اللوح الأساسي). إذا لم يستخدم المجرب النظام، فتخط هذه الخطوة (الخطوة 2.22) والخطوة التالية 2.23.
23. اخفض القضيب ببطء حتى توجد لوحة الرأس في الجزء العلوي من سوار العدسة. اخفض لوحة الرأس بمقدار 1000 ميكرومتر أكثر. حرك لوحة الرأس لعدسة GRIN المزروعة لتحديد موقعها على الحافة اليمنى للحلقة الداخلية للوحة الرأس.
    ملاحظة: يجب وضع لوحة الرأس أقل من سطح عدسة GRIN المزروعة. خلاف ذلك ، لا يمكن للمنظار المجهري الاقتراب بدرجة كافية من عدسة GRIN المزروعة لضبط المستوى البؤري بسبب الأسمنت الأكريلي.
24. ضع الأسمنت الأكريليكي لربط لوحة الرأس بطبقات الأسمنت (الشكل 1 د).
25. قم بتوصيل فيلم البارافين على سطح عدسة GRIN المزروعة لحماية سطح العدسة من الغبار. ثم ضع رابطة إيبوكسي قابلة للإزالة على فيلم البارافين للحفاظ على طبقة البارافين على سطح العدسة.
26. حقن كاربروفين ، مسكن (0.5 مجم / مل في PBS) ، وديكساميثازون ، وهو دواء مضاد للالتهابات (0.02 مجم / مل في PBS) ، في التجويف البريتوني للفأر.
    ملاحظة: تعتمد جرعة الدواء على وزن الجسم: كاربروفين (5 مجم - كجم -1 من وزن الجسم) وديكساميثازون (0.2 مجم - كجم -1 من وزن الجسم). يتم إعطاء كل من الكاربروفين والديكساميثازون بعد الجراحة ومرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بعد الجراحة.
27. امزج 0.3 ملغم / مل أموكسيسيلين ، وهو مضاد حيوي ، في ماء القفص المنزلي لإدارة الدواء لمدة أسبوع واحد.
28. أعد الماوس إلى قفص المنزل واترك 5-8 أسابيع للتعافي ونقل الفيروسات.
    ملاحظة: يتم استرداد الماوس في قفص دافئ مسبقا على بطانية كهربائية حتى يستيقظ الفأر من التخدير.

3. التحقق من صحة زرع عدسة GRIN
ملاحظة: يوفر التحقق من صحة زرع عدسة GRIN معلومات حول ما إذا كانت عدسة GRIN المزروعة مستهدفة للخلايا التي تعبر عن GCaMP. بناء على هذه المعلومات ، يوفر المجرب وقته من العمليات التي تستغرق وقتا طويلا مثل اختبار السلوك ومعالجة البيانات عن طريق استبعاد التي تم زرع عدسة GRIN غير المستهدفة. أثناء إجراء التحقق من الصحة ، يجب تركيز الخلايا ذات تعبير GCaMP في مجال عرض التسجيل. يتم استخدام قفص منزل متنقل في هذه الخطوة. قفص المنزل المتنقل هو جهاز متخصص دائري الشكل يسمح للفئران المثبتة بالرأس بتحريك أرجلها بحرية أثناء التحقق من صحة زرع عدسة GRIN ومرفق الصفيحة الأساسية. تتيح طاولة النقل الجوي في هذا الجهاز ، التي توضع عليها أرجل الفئران الثابتة على الرأس ، مثل هذه الحركة الحرة للساقين ، على الرغم من أن الرأس ثابت. عادة ما تكون الخلايا الموجودة في النواة الجانبية للوزة هادئة في حالة الراحة أو التخدير ، لذلك نادرا ما يتم اكتشاف إشارات مضان GCaMP في هذه الظروف ، مما يجعل من الصعب جدا ، وأحيانا المستحيل ، العثور على الخلايا التي تعبر عن GCaMP أثناء التحقق من صحة زرع عدسة GRIN ومرفق الصفيحة الأساسية. ومع ذلك ، غالبا ما تنتج حركة الساقين إشارات مضان GCaMP في خلايا النواة الجانبية للوزة الدماغية وبالتالي يمكن أن تساعد في تحديد موقع المجهر. وبالتالي ، يتم استخدام قفص المنزل المتنقل في هذا البروتوكول.

1. قم بتجميع مناور التجسيم في نظام قفص المنزل المتنقل.
2. قم بتخدير الفأر بغاز 1.5٪ من الأيزوفلوران. بعد أن يكون الماوس فاقدا للوعي تماما ، ضع الماوس على شريط الرأس لنظام قفص المنزل المتنقل.
3. حدد موقع قفص الكربون تحت الماوس. أغلق قفص الكربون وقم بتشغيل تدفق الهواء لجعل القفص يتحرك بحرية دون احتكاك. انتظر بضع دقائق حتى يصبح الماوس نشطا.
   ملاحظة: يجب تحسين سرعة تدفق الهواء لكل حالة تجريبية (هنا ، 100 لتر / دقيقة).
4. قم بإزالة طبقة البارافين ورابطة الإيبوكسي على سطح عدسة GRIN المزروعة وامسح سطح العدسة بنسبة 70٪ من الإيثانول باستخدام ورق العدسة.
5. قم بإعداد برنامج الحصول على البيانات (DAQ) (على سبيل المثال ، Inscopix). اضبط ظروف التصوير.
   ملاحظة: يتم استخدام برنامج DAQ للتحكم في المجهر (طاقة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) وتركيز العدسة وما إلى ذلك) وتخزين البيانات.
   1. قم بتشغيل مربع DAQ وقم بتوصيل مجهر به. بعد ذلك ، قم بتوصيله بجهاز كمبيوتر محمول إما مباشرة باستخدام كابل أو عبر الإنترنت اللاسلكي.
      ملاحظة: يتم تثبيت برنامج DAQ في جهاز إضافي يسمى صندوق DAQ (على سبيل المثال ، Inscopix). من خلال توصيل صندوق DAQ بالكمبيوتر المحمول ، يصبح برنامج DAQ متاحا في جهاز كمبيوتر محمول.
   2. قم بالوصول إلى برنامج DAQ من خلال متصفح الإنترنت (يوصى باستخدام Firefox).
   3. قم بتعيين جميع التفاصيل الضرورية (التاريخ ، معرف الماوس ، إلخ) في الجلسة المحددة. ثم انقر فوق حفظ ومتابعة. بعد الحفظ، قم بالوصول إلى جلسة التشغيل.
   4. في جلسة التشغيل، اضبط ظروف التصوير مثل وقت التعريض الضوئي والكسب والتركيز الإلكتروني وطاقة التعريض الضوئي.
      ملاحظة: يمكن تغيير طاقة الكسب والتعريض الضوئي وفقا لظروف المختبر. القيمة الموصى بها للتركيز الكهربائي هي 500 ووقت التعرض 50 مللي ثانية. لا توجد قيود على تغيير طاقة LED والكسب. ومع ذلك ، يمكن أن تسبب شدة الضوء العالية المزيد من التبييض. يحدد وقت التعرض للتسجيل معدل إطارات تسجيل الفيديو. ستقلل معدلات الإطارات الأعلى من شدة الإشارة. يجب تحسين معدلات الإطارات لأجهزة GECI المستخدمة في التصوير.
6. لتثبيت المجهر على مناور تجسيمي ، قم بتوصيل قضيب التجسيم بمقبض مجهر بمناور التجسيم.
   ملاحظة: القابض عبارة عن ملحق صغير يمكن توصيله بالجهاز التجسيمي لتثبيت جسم المجهر لوضعه في موقع الدماغ المستهدف.
7. أمسك المجهر بقابض المجهر. قم بتشغيل ضوء LED المتصل بالمجهر وقم بمحاذاة المجهر عموديا. اخفض المجهر أثناء مراقبة الصورة حتى يظهر سطح عدسة GRIN المزروعة.
8. قم بمحاذاة مركز عدسة GRIN المزروعة مع مركز الرؤية.
   ملاحظة: يمكن إجراء التحقق من صحة زرع عدسة GRIN في هذه الخطوة (المذكورة في قسم النتائج ، الشكل 2 ب ، الشكل 2 د ، الشكل 2F).
9. التقط صورة لسطح عدسة GRIN المزروعة (انقر فوق الزر Prt Sc على لوحة المفاتيح). صورة سطح عدسة GRIN المزروعة مطلوبة لإلغاء تحديد المكونات غير العصبية أثناء معالجة البيانات اللاحقة (الخطوة 6.8).
10. ابحث عن الموضع المناسب للمجهر. ارفع العدسة الموضوعية للمجهر ببطء أثناء مراقبة الصورة للبحث عن الخلايا ذات تعبير GCaMP7b.
    NOTE: قد يكون من الضروري ضبط كسب الحصول على الصورة أو طاقة التعريض الضوئي. يمكن إجراء التحقق من صحة زرع عدسة GRIN في هذه الخطوة (المذكورة في قسم النتائج ، الشكل 2 أ ، الشكل 2 ج ، الشكل 2 ه).

النتائج

الشكل 1: سير العمل التخطيطي والرسوم البيانية للجراحة التجسيمية لتصوير الكالسيوم بالمنظار المجهري في الجسم الحي في لوس أنجلوس. (أ) سير عمل تخطيطي لتصوير الكالسيوم بالمنظار المجهري في الجسم الحي في لوس أنجلوس. (ب) صورة مجهرية توضح إحداثيات ثنائية الأبعاد ل...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 26G إبرةBD302002الجراحةAAV1-Syn-GCaMP7b-WPREAddgene104493-AAV1الجراحةAAV2 / 1-CaMKiiα-GFP الجراحة حسب الطلبأكريليك - أسمنت أسنان (أورثو جيت أكريليك وردي)Lang1334-pinkالجراحة ومرفق الصفيحة الأساسية مناور تدفق الهواءNeurotarNTR000253-04مرفق الصفيحة الأساسيةAmoxicillinSIGMAA8523-5Gجراحةقفص الكربونNeurotar180 مم × 70 مممرفق الصفيحة الأساسية CarprofenSIGMAPHR1452-1Gجراحةبرنامج معالجة البياناتINSCOPIXINSCOPIX برنامج معالجة البياناتمرفق الصفيحة الأساسية واختبار السلوكديكساميثازونSIGMAD1756-500MGالجراحة الحفر ماراثون Seyang-4الجراحةالحفر بورELAUS1/2 ، Shank104جراحةإبرة زجاجيةWPIPG10165-4الجراحةعدسة GRIN (مسبار عدسة INSCOPIX Proview)INSCOPIX1050-002208جراحةحقنة هاميلتونهاميلتون84875الجراحةلوحة الرأسNeurotarموديل 5الجراحةكمبيوتر محمولSamsungNT950XBVحاملعدسة الجراحة ، قضيب Stereotaxic (طقم زرع INSCOPIX proview) INSCOPIX1050-004223القابض المجهري للجراحةINSCOPIX1050-002199مرفق الصفيحةالأساسية المجهر ، برنامج DAQ ، الأجهزةINSCOPIXnVista 3.0مرفق الصفيحة الأساسية واختبار السلوكقفص منزلي متنقلNeurotarMHC V5مرفق صفيحة قاعدة ذراع MoterizedNeurostarجراحة مخصصة برنامج ذراع MoterizedNeurostarالجراحة المخصصةرابطة الايبوكسي القابلة للإزالةWPIKwik-CastSurgeryالأسمنت الراتنج (سوبر بوند) الشمس الطبيةسوبر بوند C & Bجراحةبرغي الجمجمةStoelting51457الجراحةالإطار التجسيميStoelting51600الجراحةمناور التجسيم مرفق اللوح الأساسي Stoelting 51600