تصور الضفيرة المشيمية في دماغ الفأر باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح

الملخص

المصدر: Van Wonterghem, E., et al. التشريح المجهري والفحص المجهري الإلكتروني للمسح الضوئي الكامل للضفيرة المشيمية للفأر. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو تحضير وتصوير أنسجة الضفيرة المشيمية من دماغ الفأر باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). تتضمن العملية تثبيت الأنسجة والجفاف والطلاء بطبقة بلاتينية موصلة لتثبيت العينة وإعدادها للتصوير. يلتقط SEM صورا مفصلة للخلايا الظهارية باستخدام الزغابات الدقيقة ، مما يوفر نظرة ثاقبة على السمات الهيكلية للأنسجة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. التحليل المورفولوجي لأنسجة الضفيرة المشيمية (CP) باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)

تنبيه: يتم استخدام المحاليل السامة في خطوات المعالجة التالية. يوصى بإجراء تحضير العينة في غطاء الدخان.

1. قم بإجراء تحضير عينة ل SEM كما هو موضح أدناه.
   1. انقل CP المعزول الطازج إلى محلول تثبيت طازج يحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد و 2.5٪ جلوتارالديهايد في محلول Na-cacodylate 0.1 M (درجة الحموضة 7.4). احتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
      } ملاحظة: نظرا لأن أنسجة CP هشة للغاية ورقيقة، يجب وضع الأنسجة في سلال عينات صغيرة (انظر جدول المواد) لنقلها بين المخازن المؤقتة. بهذه الطريقة ، سيتم الحفاظ على بنية الأنسجة بشكل أفضل. يتم استخدام مثبت قائم على الكاكوديلات على محلول ملحي قائم على الفوسفات (PBS) ، حيث يمكن للمخزن المؤقت القوي للكاكوديلات مواجهة انخفاض درجة الحموضة للجلوتارالديهايد في مثبت EM.
   2. اغسل العينة 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ب 3-5 مل من 0.1 M Na-cacodylate buffer (درجة الحموضة 7.4).
   3. بعد إصلاح العينات في 3-5 مل من رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ في 0.1 M Na-cacodylate buffer لمدة 30 دقيقة. اغسل العينات 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ب 3-5 مل من الماء عالي النقاء.
   4. تجفيف العينات في سلسلة من المحاليل المثلجة ذات تركيزات الإيثانول المتزايدة (50٪ ، 70٪ ، 85٪ ، 100٪) ، لمدة 15 دقيقة لكل محلول EtOH. استخدم مجفف النقاط الحرجة لتجفيف العينة بشكل صحيح. ملاحظة : يؤثر التغيير من الطور السائل إلى الغاز على التوتر السطحي ، مما يتسبب في تلف بنية السطح. تسمح خطوة تجفيف النقطة الحرجة بالحفاظ على بنية السطح.
   5. ضع العينة بعناية على حامل عينة مزود بملصق كربوني (انظر جدول المواد).
   6. قم بتغطية العينات بطبقة رقيقة (2-5 نانومتر) من البلاتين. للقيام بذلك ، قم بتركيب مصدر بلاتيني في نظام تفريغ بين محطتين كهربائيتين عالية التيار وقم بتسخين البلاتين إلى درجة حرارة التبخر. يتم ترسيب تيار دقيق من البلاتين على العينة. ملاحظة: إلى جانب البلاتين ، يمكن أيضا استخدام الذهب أو الذهب / البلاديوم.
2. تصور عينات CP باستخدام SEM (انظر جدول المواد). يشبه إجراء تصور أنسجة الشلل الدماغي عبر SEM إجراء الأنواع الأخرى من الأنسجة ويعتمد على البرامج المستخدمة والأدوات.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات عينة الألومنيوم يتصاعدEM Sciences75220 Cacodylate bufferEMSciences 11652 علامات تبويب لاصقة كربونية -12 ممEM Sciences77825-12 مجفف النقاط الحرجةBal-TecCPD030 Crossbeam 540Zeiss SEM systemملقطأدوات العلوم الدقيقة GmbH91197-00 GlutaraldehydeEM Sciences16220 أوزميوم رباعي أكسيدEMSciences 19170 بارافورمالدهيدسيجما ألدريتشP6148 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) Lonza BE17-516F PlatinumQuorumQ150T ESPBS بدون Ca⁺⁺ أو Mg⁺⁺ أو الفينول الأحمر ؛ سلة عينة معقمة مصفاةمن الفولاذ المقاوم للصدأ EM Sciences70190-01