التصوير الفلوري لديناميكيات الكالسيوم المشبكي في نموذج في المختبر للتصلب الجانبي الضموري

الملخص

المصدر: Krishnamurthy، K. et al. قياس الفلورسنت في الوقت الحقيقي للوظائف المشبكية في نماذج التصلب الجانبي الضموري. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تصوير الكالسيوم في الوقت الفعلي لمراقبة النشاط المشبكي في الخلايا العصبية المتحولة بمرض التصلب الجانبي الضموري الذي يعبر عن مستشعر حيوي للكالسيوم مشفر وراثيا. يحدد خطوات إعداد الخلايا العصبية للتصوير ، وتحفيز ديناميكيات الكالسيوم ، وتسجيل التألق لقياس التغيرات في الوقت الفعلي في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، والتي تعكس النشاط المشبكي العصبي.

البروتوكول

1. التصوير الفلوري ل Gcamp6m عابرة الكالسيوم

1. العابرة للخلايا العصبية القشرية الأولية للقوارض المستزرعة على أطباق ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم مع 500 نانوغرام من Gcamp6m.
   ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، قم بتوصيل الخلايا العصبية بشكل مشترك مع البلازميد ذي الأهمية التي تحتوي على علامة فلورية في النطاق الأحمر أو الأحمر البعيد.
2. احتضان الخلايا العصبية ذات السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي منخفض كلوريد البوتاسيوم (KCl) (الجدول 1) لمدة 15 دقيقة ، 48 ساعة بعد التعدي ، ثم قم بتركيب الطبق على منصة التصوير.
3. تصور مضان GCaMP6m باستخدام مرشح إيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC) (488 نانومتر) وهدف 20x أو 40x.
4. حدد مجال التصوير وقم بالتركيز البؤري المثالي. بعد ذلك ، التقط صورة ثابتة واحدة مع قنوات علامة المجال الساطع و FITC والتألق لتحديد حدود الخلايا العصبية.
5. بدء التشغيل الآن في برنامج الاستحواذ. قم بإجراء التسجيل الأساسي لمدة 5 دقائق ثم قم بتسخينه باستخدام aCSF الذي يحتوي على 50 ملي مولار KCL (الجدول 1).
   ملاحظة: الهدف من هذا التصوير هو قياس عابرات الكالسيوم المستحثة. إذا كان للخلايا العصبية نشاط إطلاق قاعدي وتدفقات الكالسيوم خلال فترة ما قبل التحفيز ، فلا يتم استخدامها في تحليل البيانات. بدلا من ذلك ، يتم استخدام الخلايا ذات التألق الخلفية المستقرة فقط. يمكن أيضا تمديد فترات ما بعد التحفيز إلى 60 دقيقة لعابرة الكالسيوم ، مع أو بدون نضح إضافي مستمر عالي من كلوريد كلوريد النوع.
6. احفظ التجربة وحلل البيانات باستخدام برنامج متحد البؤر. قد يتم إيقاف التجربة في هذه المرحلة ، ويمكن إجراء التحليل لاحقا.
   ملاحظة: إذا كانت الخلايا لا تتطلب تعداء للتعبير عن البروتينات ذات الأهمية ، فيمكن تنفيذ هذا البروتوكول في أي وقت في المختبر عند السعي لفحص عابرات الكالسيوم. بعد اختبار خلايا التحكم لضمان قياس عابرات الكالسيوم ، يجب أن يعمى المجرب عن الظروف الجينية أو الدوائية لكل طبق تم اختباره لتقليل التحيز.

2. تحليل الصور

1. افتح صور الفاصل الزمني باستخدام برنامج متحد البؤر.
2. محاذاة الصور في سلسلة اللقطات المتتابعة بواسطة سلسلة الأوامر: Image | المعالجة | محاذاة المستند الحالي. حدد محاذاة مع الإطار الأول.
3. حدد مناطق الاهتمام (ROIs) على طول الخلايا العصبية باستخدام أداة تحديد عائد الاستثمار، وهي أيقونة على شكل حبة الفول على يمين إطار الصورة. أيضا ، ضع علامة على عائد الاستثمار الذي يمثل شدة مضان الخلفية.
   ملاحظة: يتم تحديد عائد الاستثمار عن طريق اختيار مناطق النقاط الفاصلة المنفصلة بشكل واضح على طول المسارات العصبية المشار إليها بواسطة الصورة الثابتة للمجال الساطع. يتم اختيار ما لا يقل عن خمسة عائد استثمار لكل خلية عصبية للتحليل. يتم اختيار عائد الاستثمار في الخلفية في منطقة من مجال الرؤية لا تحتوي على عصبيات.
4. قم بقياس التألق الخام بمرور الوقت لعائد استثمار محدد باستخدام سلسلة الأوامر التالية: قياس | قياس الوقت.
   1. ابدأ وظيفة القياس في الجزء العلوي من لوحة قياس الوقت. يتم إنشاء تمثيل رسومي للتألق الخام بمرور الوقت والبيانات الكمية.
      ملاحظة: تمثل كل نقطة بيانات التألق الخام لعائد الاستثمار هذا للإطار المرتبط بتلك النقطة الزمنية المحددة المقاسة.
5. تصدير شدة التألق الخام إلى برنامج جداول البيانات.

الجدول 1: تكوين مخازن السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF).

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = "تعويم: يسار ؛" >< فئة الجدول = 'ck-table-resize'> المخزن المؤقت منخفض KCL aCSF (الرقم الهيدروجيني 7.40 إلى 7.45) تركيز الكاشفHEPES10 مليكلوريد الصوديوم140 مليكلوريد الصوديوم5 ملي مولارجلوكوز10 مليكلوريد_{الكالسيويد 2} 2 ساعة₂م2 مليملي كلوريد_{المغنيد 2} 4 ساعات₂س1 ملي ارتفاعKCL aCSF العازلة (درجة الحموضة 7.40 إلى 7.45) تركيز الكاشفHEPES10 مليكلوريد الصوديوم95 مليكلوريد الصوديوم50 مليجلوكوز10 مليكلوريد_{الكالسيوم 2} 2 ساعة₂س2 مليمللي كلوريد₂ 4 ساعات₂أو1 ملي

المواد