الفحص المجهري الثلاثي الأبعاد ثنائي الفوتون لدراسة النشاط العصبي والاتصال في نموذج الفأر

الملخص

المصدر: Kato, D. et. al. ، تقييم ومعالجة النشاط العصبي باستخدام الفحص المجهري الثلاثي الأبعاد ثنائي الفوتون. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو تقنية التصوير ثنائي الفوتون جنبا إلى جنب مع علم البصريات الوراثي باستخدام الفحص المجهري الثلاثي الأبعاد. باستخدام معدل الضوء المكاني ، تتيح هذه التقنية التحفيز العصبي الدقيق للتعبير عن البروتين الحساس للضوء الأحمر وتصوير الكالسيوم بأقل قدر من التلف الضوئي. يوفر هذا النهج رؤى حول الاتصال الوظيفي وتنظيم الشبكات العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. زرع صفيحة الرأس (الشكل 1 أ)

1. قم بتطبيق المخدر (خليط من 74 مجم / كجم من الكيتامين و 10 مجم / كجم زيلازين) داخل الصفاق لتخدير الفأر. تحقق من حالة تخدير الماوس بشكل متكرر من خلال تقييم ردود الفعل الدواسة.
2. بعد التخدير ، ضع الماوس في أداة تجسيمية. ضع مرهما للعين (انظر جدول المواد) لمنع القرنية من الجفاف عند زرع صفيحة الرأس.
3. حلق المنطقة الجراحية وتطهير الجلد بثلاث جولات متناوبة من مقشرات بوفيدون اليود أو الكلورهيكسيدين متبوعة بمناديل كحولية بنسبة 70٪. قم بتعريض الجمجمة بعناية وتنظيفها بمسحات قطنية.
   ملاحظة: يجب تعقيم جميع الأدوات الجراحية ، ويجب تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لذلك. أي بقايا متبقية (مثل الشعر أو الدم الجاف) تسبب ردود فعل التهابية. لذلك ، يجب إزالة أي حطام تحت مجسم باستخدام مسحات قطنية مبللة بالماء المعقم أو الكحول بنسبة 70٪.
4. استخدم الإحداثيات التجسيمية - الأمامية والخلفية = 0.5 مم ، الإنسي والجانبي = 1.5 مم من bregma - للعثور على مركز حج القحف وتسميتها بقلم تحديد.
5. ضع صفيحة رأس مصنوعة خصيصا في وسط الجمجمة. بعد ذلك ، ضع أسمنت الأسنان (انظر جدول المواد) لتثبيته بإحكام على الجمجمة. استخدم ضغطا خفيفا حتى تتلامس لوحة الرأس بقوة مع الجزء الأمامي والخلفي من الجمجمة.
   ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة حوالي 20 دقيقة حتى تكتمل وهي ضرورية لتقليل القطع الأثرية للحركة في الدماغ أثناء التصوير ثنائي الفوتون. أبعاد لوحة الرأس 20 مم × 40 مم × 1 مم مع فتحة على شكل لوحة منزلية بحافة واحدة بطول 15 مم ، وجانبين متجاورين بطول 3 مم ، والجانبين المتبقيان بطول 10 مم.
6. امزج أسمنت راتنج الأسنان اللاصق القائم على الأكريليك معا على النحو التالي: نصف ملعقة من المسحوق ، وثلاث قطرات من السائل ، وقطرة واحدة من المحفز (انظر جدول المواد). لمنع الجفاف ، ضع هذا الأسمنت الراتنج اللاصق المختلط على سطح الجمجمة السليم للفأر باستخدام لوحة الرأس.
7. ضع الفأر في قفص دافئ حتى يتعافى من التخدير. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.

2. الجراحة وحقن الفيروسات المرتبطة بالغدة (AAV) (الشكل 1 ب)

1. إجراء حج القحف أو الحقن الفيروسي دون إزالة الأسمنت الراتنج اللاصق للأسنان من الجمجمة بعد يوم واحد من زرع صفيحة الرأس.
   ملاحظة: قم بإعطاء التخدير (خليط من 74 مجم / كجم من الكيتامين و 10 مجم / كجم زيلازين) داخل الصفاق للفأر أثناء هذا الإجراء.
2. لتجنب الوذمة الدماغية، يتم تطبيق ديكساميثازون فوسفات الصوديوم (1.32 ملغم/كغ) داخل الصفاق قبل ساعة واحدة من الجراحة.
3. قم بتخدير الماوس بلوحة الرأس بتخدير الأيزوفلوران بنسبة 1٪ باستخدام المرذاذ (نظام توصيل التخدير) مع الحفاظ على درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة تسخين. ضع مرهما للعين لمنع جفاف القرنية.
4. تحت المجسم ، قم بإجراء بضع قحف دائري يبلغ قطره حوالي 2 مم باستخدام مثقاب الأسنان. لتقليل تلف الدماغ ، قم بتشغيل مثقاب الأسنان بعناية بحركة طفيفة ثابتة وضغط خفيف لأسفل.
5. قم بإزالة شظايا العظام عدة مرات باستخدام نظام الشفط. بعد إزالة شظايا العظام ، استخدم محلول السائل الشوكي الاصطناعي (ACSF) لإزالة وغسل أي بقايا متبقية على سطح الدماغ. كرر إجراء التنظيف هذا عدة مرات لقمع التفاعلات الالتهابية.
   ملاحظة: تم تخزين محلول ACSF (140 ملي كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد البوتاسيوم ، KCl ، 5 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك ، HEPES ، 2.0 ملي كلوريد الكالسيوم ، كلوريد_{الكالسيوم 2} ، و 1.0 ملي كلوريد المغنيسيوم ، MgCl₂) تم تخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد بعد إذابة الكاشف وتصفيته (حجم المسام = 0.22 ميكرومتر).
6. باستخدام نظام حقن الضغط (انظر جدول المواد) ، اضبط الضغط المناسب (حوالي 10 أرطال لكل بوصة مربعة (PSI) في نبضات مدتها 4 مللي ثانية) لحقن 500 نانولتر من محلول AAV من خلال شعرية زجاجية بقطر طرف 10-20 ميكرومتر (محضرة باستخدام مجتذب ماصة دقيقة) لمدة 10 دقائق.
7. حدد ما إذا كان محلول AAV يتم إعطاؤه للدماغ عن طريق التحقق مما إذا كان مستوى محلول AAV في الشعيرات الدموية الزجاجية ينخفض تدريجيا.
8. اترك الشعيرات الدموية الزجاجية في مكانها لمدة 10 دقائق إضافية لمنع التدفق العكسي. كرر ثلاث مرات لإعطاء ما مجموعه 1.5 ميكرولتر من محلول AAV في الدماغ.
9. لتقييم ومعالجة النشاط العصبي في الخلايا الهرمية من الطبقة 2/3 (L2 / 3) ، قم بحقن محلول AAV (لتصوير Ca²⁺: AAV2 / 1-Syn-jGCaMP8f-WPRE عند 1.28 ×^{10 14} جينوم متجه / مل ، مخفف 1: 1 في محلول ملحي ؛ لتصوير Ca²⁺ باستخدام علم البصريات الوراثي: AAV2 / 8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE في 1.73 × 10¹⁴ جينومات المتجهات / مل ، مخففة 1: 1 في محلول ملحي) في منطقة المخلب الخلفي للقشرة الحسية الجسدية الأولية للفئران البرية (S1 ، متمركزة عند 0.5 مم خلفي و 1.5 مم جانبي من البرجما ، عمق 150 ميكرومتر من السطح).
   ملاحظة: يجب حقن محلول AAV في 2-3 أسابيع و 1-2 أسابيع قبل التصوير لتعبير jGCaMP8f و GCaMP6m-P2A-ChRmine ، على التوالي.
10. بعد تطبيق 2٪ (وزن / حجم) من الاغاروز منخفض الذوبان على سطح دماغ S1 باستخدام ماصة دقيقة ، ضع نافذة زجاجية فوق حج القحف مع كأسين للغطاء. قم بتوصيل زجاجي الغطاء (قطر صغير 2.0 مم وقطر كبير 4.5 مم ؛ انظر جدول المواد) بمادة لاصقة قابلة للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية (UV).
11. اضغط على زجاج الغطاء على الاغاروز وهو لا يزال سائلا ؛ هذا يمنع تكوين فقاعات الهواء في الاغاروز. أغلق حواف نافذة الجمجمة بأسمنت راتنج الأسنان والمواد اللاصقة (الشكل 1 ج).
12. قم بإزالة الماوس من الأداة التجسيمية وأعده إلى قفصه. ضع الفأر في قفص دافئ ولا تعود إلى القفص مع الأخرى حتى يتعافى تماما من التخدير. حافظ على الظروف المعقمة بعناية أثناء جراحة البقاء على قيد الحياة.
13. خلال ال 72 ساعة الأولى بعد الجراحة ، تحقق من الحالة الصحية للفأر من خلال مراقبة السلوك العام. إذا كان هناك أي تشوهات في السلوك العام ، فقم بحقن العوامل المضادة للالتهابات والمسكنات تحت الجلد.

3. التحضير لنظام التحفيز أو الإضاءة الثلاثية الأبعاد (الشكل 2)

1. معايرة نظام التحفيز الثلاثي الأبعاد عن طريق وضع سطح شريحة مضان حمراء (ركيزة أكريليك مصبوبة) في مستوى العينة. ضع المجهر في وضع التصوير المباشر مع ضوء إثارة ضعيف وقم بتشغيل ملف calibration_GUI.m. تحقق من جزء المعلمات وانقر فوق الزر حفظ.
2. انقر فوق الزر Z Scan في جزء الخطوة 1. سيولد تلقائيا ثلاث نقاط عشوائية في جميع المستويات المحورية ال 21 ، بفارق 2 ميكرومتر عن كل مستوى.
3. حرك شريط التمرير وتحقق من الصورة الحية. ابحث عن مستوى مثالي حيث تظهر البقع الأصغر والأكثر سطوعا ، ثم انقر فوق حفظ زر. سيؤدي هذا تلقائيا إلى إنشاء واجهة موجية كروية لإزاحة الهولوغرام الرقمي.
   ملاحظة: إذا فشلت في العثور على ألمع بقع التألق ، فقم بتغيير الحد الأدنى والأقصى للقيم لنطاق المسح وحاول مرة أخرى.
4. انقر فوق الزر "انتقال" في جزء الخطوة 2، ثم انقر فوق ستة نقاط على المربع الأيسر. تحقق من الصورة الحية. إذا كانت هناك ست بقع مضان يمكن تمييزها ، فاكتب محورها x و y في مربعات التحرير وانقر فوق حفظ زر. سيؤدي هذا تلقائيا إلى إنشاء معاملات تحويل أفيني لتنسيق المعايرة بين التحفيز المجسم ونظام التصوير.
   ملاحظة: يجب مطابقة رقم زوج المحور ورقم البقعة الذي تم النقر عليه بالترتيب. إذا لم تكن متأكدا ، أو إذا لم تكن هناك بقع في صورتك ، فيرجى المحاولة مرة أخرى وإنشاء نمط موضعي فريد أو اختيار نطاق أصغر حول مركز مجال الرؤية (FOV).
5. انقر فوق الزر Scan في جزء الخطوة 3. سيقوم بإنشاء 441 صورة ثلاثية الأبعاد رقمية لإجراء مسح موضعي واحد عبر مجال الرؤية في 21 × 21 خطوة.
   1. أولا، تحقق من الصور أثناء تغيير الأنماط في مربع القائمة. بعد ذلك ، اضبط طاقة الليزر للحصول على صور موضعية ضمن النطاق الديناميكي لجهاز التصوير (على سبيل المثال ، لتجنب الصور المشبعة بشكل مفرط).
   2. بعد ذلك ، اضبط وقت الفاصل الزمني في مربع التحرير ؛ يجب أن يكون وقت الفاصل الزمني أكثر من ضعف وقت الفاصل الزمني للتسجيل. أخيرا ، ضع جهاز التصوير في وضع التسجيل وانقر فوق الزر ". إذا اكتملت التشغيل ، فستكون هناك سلاسل "عرض موافق" معروضة في نافذة الأوامر. توقف عن التسجيل وقم بتكديس الصور المتسلسلة المسجلة باستخدام طريقة الحد الأقصى للكثافة.
6. انقر فوق إنشاء WM في جزء الخطوة 4 واختر صورة مكدسة من الأعلى. ثم أغلق نافذة calibration_GUI. سيقوم تلقائيا بإنشاء خريطة وزن للتعويض عن الشدة غير المتوازنة في كل بقعة.
   ملاحظة: للحصول على وصف أكثر تفصيلا ، يمكن تنزيل رمز MATLAB من هنا (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. تصوير Ca²⁺ باستخدام مستشعر صورة مع إضاءة ثلاثية الأبعاد (الشكل 3)

1. ضع الماوس المحقون ب AAV مع لوحة رأس تحت المجهر (الشكل 1D).
   ملاحظة: خلال هذا الإجراء ، يتم تقييد الماوس في حالة اليقظة ، ولكنه قادر على الهروب من المحفزات غير المريحة.
2. قم بإجراء تصوير ثنائي الفوتون (وضع المسح الضوئي النقطي) باستخدام مجهر ثلاثي الأبعاد وليزر Ti: ياقوت مغلق في الوضع تم ضبطه على 920 نانومتر مع هدف 25x (انظر جدول المواد).
3. قم بتشغيل برنامج التصوير التجاري (انظر جدول المواد). في وضع التصوير المباشر ، اضبط جهد كاشف الصور (انظر جدول المواد) وقوة ليزر التصوير لتحسين سطوع الخلايا العصبية التي تعبر عن jGCaMP8f. التقط صورا للخلايا العصبية التي تعبر عن هذا البروتين.
   ملاحظة: شدة ليزر التصوير (920 نانومتر) هي 20-30 ميغاواط. كان مجال الرؤية 512 ميكرومتر × 512 ميكرومتر على عمق 100-150 ميكرومتر من السطح القشري.
4. لإلقاء الضوء على خلايا عصبية معينة تعبر عن jGCaMP8f بإضاءة ثلاثية الأبعاد ، قم بتشغيل ملف البرنامج النصي SLMcontrol.m. انقر على الصورة المرجعية واختر الصورة التي تم الحصول عليها أعلاه. ثم انقر فوق بقعة زر لاختيار وحدات بكسل معينة على الخلايا العصبية في الصورة عن طريق النقر المستمر بالماوس (الشكل 3 أ). إذا اكتمل التحديد، فاضغط على زر Enter على لوحة المفاتيح لإنهائه.
   ملاحظة: يتم حساب الهولوغرام الرقمي تلقائيا وعرضه على معدل الضوء المكاني (SLM). يمكن أيضا إعادة النظر في هذا النمط بالنقر فوق مربع القائمة. كانت الدقة المكانية لبقعة واحدة تم إنشاؤها بواسطة SLM حوالي 1.2 ميكرومتر على طول الاتجاه العرضي و ~ 8.3 ميكرومتر على طول المحور البصري. استخدمنا عدسة موضوعية ذات فتحة عددية عالية (1.1) لتحقيق المزيد من التحفيز الثلاثي الأبعاد الموضعي.
5. للكشف عن النشاط العصبي بدقة زمنية عالية باستخدام مستشعر الصورة (انظر جدول المواد) ، اضبط وقت التعرض ومنطقة التصوير والتجميع (الشكل 3 ب) قبل إجراء الحصول على الصورة (الشكل 3 ج).
   ملاحظة: شدة ليزر الإضاءة الثلاثية الأبعاد (920 نانومتر) الذي يحفز باستمرار خلية عصبية واحدة هي 2 ميغاواط ، وهو ما يكفي لاكتشاف النشاط العصبي. على سبيل المثال ، لتحقيق معدل إطارات 100 هرتز للتصوير ، يكون وقت التعرض 9 مللي ثانية ، ومساحة التصوير 400 ميكرومتر × 400 ميكرومتر ، والتجميع هو 4.
6. بعد التجربة ، أعد الفأر إلى قفص منزله.

5. التصوير ثنائي الفوتون (وضع المسح الضوئي النقطي) باستخدام علم البصريات الوراثي باستخدام مجهر ثلاثي الأبعاد (الشكل 4)

1. كرر الخطوتين 4.1 و 4.2.
2. قم بتشغيل برنامج التصوير التجاري (انظر جدول المواد). في وضع التصوير المباشر ، اضبط جهد كاشف الصور (انظر جدول المواد) وقوة ليزر التصوير لتحسين سطوع الخلايا العصبية التي تعبر عن GCaMP6m-P2A-ChRmine. التقط صورا للخلايا العصبية التي تعبر عن هذه البروتينات (الشكل 1E).
3. كرر الخطوة 4.4.
4. للتحقيق في الاتصال الوظيفي داخل الخلايا العصبية L2 / 3 ، استخدم SLM لإنشاء أنماط ثلاثية الأبعاد للتحفيز البصري الوراثي (ChRmine ؛ 1,040 نانومتر) ودمجها مع تصوير Ca²⁺ ثنائي الفوتون (GCaMP6m ؛ 920 نانومتر ، 512 × 512 بكسل ، 2 هرتز أو 30 هرتز ، تقريب رقمي 2x ، وضع مسح نقطي ؛ الشكل 3D-H).
   1. بالنسبة لهذا البروتوكول، اضبط شدة ليزر التصوير على 920 نانومتر، عند 10-20 ميغاواط، ومجال الرؤية على أنه 256 ميكرومتر × 256 ميكرومتر مقاسة على عمق 100-150 ميكرومتر من السطح القشري. اضبط وقت بقاء البكسل على 1.5 ميكرو ثانية ل 2 هرتز أو 100 نانوثانية ل 30 هرتز.
   2. لمعرفة ما إذا كان حافز ثلاثي الأبعاد واحد تسبب في استجابة الكالسيوم في الخلايا العصبية ، استخدم كلا من 2 هرتز و 30 هرتز كمعدل إطار للتصوير. اضبط شدة ليزر التحفيز الثلاثي الأبعاد (1,040 نانومتر) الذي يحفز خلية عصبية واحدة عند 10 ميجاوات ، وهو ما يكفي للحث على النشاط العصبي (الشكل 3D).
      ملاحظة: تبلغ الدقة المكانية لبقعة واحدة تم إنشاؤها بواسطة SLM حوالي 1.2 ميكرومتر على طول الاتجاه العرضي و ~ 8.3 ميكرومتر على طول المحور البصري. يبلغ نطاق الحجم الذي يمكن الوصول إليه في الاتجاه الجانبي حوالي 500 ميكرومتر × 500 ميكرومتر و 100 ميكرومتر في الاتجاه المحوري. لقد أكدنا أيضا من خلال تصوير Ca^{2 +} بمعدل إطارات تصوير 2 هرتز أو 30 هرتز أنه لا يمكن تحفيز خلية عصبية واحدة فحسب ، بل يمكن تحفيز خلايا عصبية متعددة بشكل ثلاثي الأبعاد في وقت واحد (الشكل 3E).
5. قم بإجراء الحصول على الصور باستخدام البروتوكول التالي: قم بتصوير استجابة Ca²⁺ في نفس الوقت عند 920 نانومتر مع 10 محفزات ثلاثية الأبعاد عند 1,040 نانومتر بفواصل زمنية 8 ثوان (0.125 هرتز) لمدة 50 مللي ثانية بعد فترة خط الأساس البالغة 10 ثوان.

النتائج

الشكل 1: مخطط تخطيطي للإجراء التجريبي. ( أ) تثبيت لوحة الرأس على الجمجمة. (B) الحقن التجسيمي ل AAV في منطقة المخلب الخلفي للقشرة الحسية الجسدية الأولية (S1HL). (C) زرع نافذة الجمجمة. لتقييم النشاط العصب...

المواد