تصوير الكالسيوم في الوقت الحقيقي لقشرة الفص الجبهي الإنسي للفأر باستخدام منظار مصغر

الملخص

المصدر: Thapa, R., et. al., الحقن الفيروسي التجسيمي وزرع عدسة مؤشر التدرج للدماغ العميق في الجسم الحي تصوير الكالسيوم. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح الفيديو تصوير الكالسيوم في الوقت الفعلي باستخدام منظار مصغر في فأر متحول ، مما يربط النشاط العصبي بالسلوك.

البروتوكول

تركيب المنظار المصغر و في الجسم الحي Ca^{} 2+} التصوير (الشكل 1)

1. {{}} قم بتركيب المنظار المصغر على قاعدته
   1. تخدير الماوس لفترة وجيزة في غرفة الحث (5٪ إيزوفلوران و 1 لتر / دقيقة معدل تدفق الأكسجين). ضع الماوس على سطح مقعد نظيف.
   2. قم بفك برغي القفل بمفك براغي صغير ، وقم بإزالة الغطاء الواقي ، وتنظيف سطح عدسة GRIN (عدسة مؤشر التدرج) باستخدام قطعة قطن مبللة بالأسيتون.
   3. لف شريط PTFE (شريط بولي تترافلورو إيثيلين) بإحكام حول خيط المنظار المصغر واربط المصغر بقاعدته على رأس الماوس.
   4. قم بتوصيل المنظار المصغر بالكابل ( الشكل 2K ) ، وقم بتشغيل برنامج NeuView.
   5. في NeuView ، انقر فوق الأجهزة ، وتحقق من LED1 ، وانقر فوق الزر دفق لعرض الصور الحية ( الشكل 3 أ ).
   6. حدد أفضل مستوى بؤري عن طريق ضبط موضع المنظار المصغر بالنسبة للقاعدة ، إما شد أو فك قليلا بمساعدة ملقط حاد.
      ملاحظة: يتم تحديد أفضل مستوى بؤري من خلال مقارنة العديد من المواقع المحتملة واختيار الموقع الذي يحتوي على تصور واضح لمعظم أجسام الخلايا.
   7. شد برغي القفل وضع الماوس مرة أخرى في قفص منزله.
   8. في NeuView ، اضبط طاقة ضوء LED على المستوى الأمثل. انقر فوق التقط ثم قم بتشغيل أزرار لبدء التسجيل واضغط على إيقاف بعد 150 إطارا.
      ملاحظة: تحدد أقل طاقة ممكنة المستوى الأمثل لطاقة LED لتحقيق صورة ساطعة بدرجة كافية. الغرض من تسجيل مقطع فيديو قصير هو تسهيل تحديد نفس المستوى البؤري في المستقبل للتصوير المتكرر.
   9. افصل الكابل عن المنظار المصغر. دع الماوس يتعافى لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء التجربة.
      ملاحظة: لحماية المنظار المصغر ، عادة ما تتم إزالة زجاجة الماء ووحدة تغذية الطعام السلكية خلال هذه الفترة الزمنية القصيرة. إذا احتاج الفأر إلى البقاء في قفص منزله لفترة أطول ، فمن المستحسن توفير هلام الحمية المتاح تجاريا (انظر جدول المواد ) في قفص المنزل.
2. الحصول على البيانات ل في الجسم الحي تصوير الكالسيوم
   }ملاحظة: في الجسم الحي ، يمكن إجراء تصوير الكالسيوم في وقت واحد مع أي اختبارات سلوكية يرغب فيها الباحث. لأغراض العرض التوضيحي ، المثال هنا هو في الجسم الحي Ca ^{2 +} أثناء اختبار المجال المفتوح. لتحقيق هذا الهدف ، يلزم وجود جهازي كمبيوتر. تم تجهيز أحد أجهزة الكمبيوتر ببرامج تجارية (انظر جدول المواد) للتحكم في الكاميرا لتسجيل سلوك الماوس تلقائيا. تم تجهيز الكمبيوتر الآخر ب NeuView للتحكم في المنظار المصغر وتسجيل صور Ca ^{2 +} .
   1. قم بتشغيل برنامج كاميرا السلوك (راجع جدول المواد) لعرض ساحة سلوك الماوس من خلال وظيفة البث المباشر. اضبط تركيز الكاميرا العلوية يدويا ( الشكل 2L ).
   2. حدد Trigger/Strobe وتحقق من "تمكين / تعطيل المشغل" ( الشكل 3B ). انقر فوق الزر تسجيل ، واستخدم تصفح لتحديد الموقع الذي سيتم حفظ تسجيلات السلوك فيه، وحدد تنسيق الصورة المطلوب.
      ملاحظة: تم تمكين وظيفة "التحكم في المشغل" للسماح بتشغيل تسجيل السلوك بواسطة برنامج NeuView بحيث يتم ربط إطارات السلوك وإطارات تصوير الكالسيوم المقابلة معا مؤقتا. يمكن حفظ تسجيل السلوك بأي تنسيق مطلوب. يتم حفظ تسجيل السلوك بشكل عام بتنسيق JPEG في المجلد المخصص.
   3. اقترب الماوس من الساحة وقم بتوصيل المنظار المصغر بالكابل المرتبط بنظام الحصول على البيانات ( الشكل 2L) (انظر جدول المواد). ثم يتم وضع الماوس في وسط الساحة.
   4. باستخدام وظيفة البث المباشر لبرنامج NeuView ، اضبط طاقة LED لتحسين سطوع صورة الكالسيوم.
      ملاحظة: بالنسبة لتصوير الكالسيوم، يكون معدل إطارات التسجيل 10 إطارات / ثانية افتراضيا.
   5. في NeuView ، قم بإلغاء تحديد LED1 ، وانقر فوق الالتقاط ، ثم قم بتشغيل لبدء التسجيل ، واضغط على إيقاف بعد 100 إطار.
      ملاحظة: هذا لتسجيل صور الخلفية لحوالي 100 إطار مع إطفاء مصابيح LED.
   6. في برنامج كاميرا السلوك، انقر فوق بدء التسجيل ( الشكل 3C). في NeuView ، تحقق من LED1 ، وانقر فوق الالتقاط ، ثم قم بتشغيل لبدء التسجيل. اضغط على إيقاف بعد 3000 إطار.
      ملاحظة: هذا لتسجيل تصوير الكالسيوم وسلوكه في وقت واحد. يبلغ طول اختبار المجال المفتوح 15 دقيقة ، وعادة ما يتم تقسيمه إلى ثلاث جلسات تسجيل مدة كل منها 5 دقائق. هذا لمنع ارتفاع درجة حرارة المنظار المصغر بسبب الاستخدام المستمر.
   7. احفظ كل من تسجيلات تصوير الكالسيوم والسلوك في المجلدات المخصصة. كرر التسجيل لجلستين أخريين أثناء تسجيل الخلفية قبل كل جلسة، واحفظ جميع التسجيلات في المجلد المخصص.

النتائج

الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الإجراء التجريبي. ( أ) الحقن التجسيمي للفيروس في mPFC (قشرة الفص الجبهي الإنسي). (B) زرع عدسة GRIN (عدسة مؤشر التدرج) في mPFC. (C) لصق قاعدة المنظار المصغر على ...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات AcetoneSigma-Aldrich179124-1LGRIN lenscleaner برنامج إعادة ترميز السلوك (Point Grey FlyCap2)Point GreyPoint Grey Gray Research Blackfly BFLY-PGE-12A2Cلتسجيل سلوكالحصول على البيانات وحدة تحكمNIDA / IRP مكون مصمم خصيصالنظام الحصول على الصور كابل نقل البياناتNIDA / IRPمصمم خصيصامكون نظام الحصول على الصور عدسة GRINGRINTECHNEM-100-25-10-860-Sلزرع عدسة GRINقاعدة منظار مصغرProtolabsمصممة خصيصالتركيب المنظار الأساسيالمصغر ذراع القابضNIDA / IRPمصمم خصيصالتركيبغطاء حماية المنظارالأساسي Protolabsمصمم خصيصالحماية المنظارالمصغر وحدة التحكم الآليةThorlabsKMTS50E لتركيب القاعدةNeuViewNIDA / IRPhttps://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0للتصوير في الجسم الحيمرهم العيونPuralube Vet OintmentNDC 17033-211-38شريط عيون Polytetrafluoroethylene (PTFE)TegaSeal PTFE TapeA-A-58092لتثبيت miniScope على القاعدةمسحة قطنية معقمةPuritanREF 806-WCلكلتا الجراحين