$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. إعداد المجهر للتصوير بفاصل زمني
< نمط p = 'margin-left: 40px;'>
1. تحديد إعدادات الليزر1. تحديد الطول الموجي لليزر لاستخدامه. استخدم طولا موجيا يبلغ ضعف الطول الموجي للإثارة للفلوروفور محل الاهتمام (على سبيل المثال ، الطول الموجي بين 880 و 940 نانومتر للبروتين الفلوري الأخضر (GFP).
ملاحظة: في الدراسة الحالية ، كان إعداد الطول الموجي ل GFP بين 880 و 940 نانومتر. كلما زاد الطول الموجي ، انخفضت طاقة خرج الليزر.
2. تحديد الإرسال بالليزر. نسبة عالية من انتقال الليزر ستقتل الجنين ، وتستخدم أدنى مستوى من الانتقال (موصى به). بالنسبة لدراسات الفاصل الزمني لمدة 24 إلى 48 ساعة، كما هو معروض هنا، حافظ على انتقال العدوى أقل من 5٪.
3. تحديد أنظمة الكشف عن المجهر والتأكد من وجود المرشحات الصحيحة للفلوروفور.
ملاحظة: بالنسبة للمجاهر متعددة الفوتونات، هناك أنظمة كشف متعددة ذات حساسيات مختلفة للتألق المنبعث. بشكل عام ، يتمتع نظام الكشف الداخلي بحساسية أقل من نظام الكشف الخارجي. بالنسبة للخطوط المعدلة وراثيا ذات المستويات العالية من التعبير عن GFP ، يكون نظام الكشف الداخلي مناسبا. بالنسبة للخطوط المعدلة وراثيا ذات المستويات المنخفضة من تعبير GFP أو مع الفلوروفورات الأخرى (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأحمر) ، قد تكون هناك حاجة إلى نظام كشف خارجي للحفاظ على النسبة المئوية لنقل الليزر عند مستوى معقول. بغض النظر عن نظام الكشف المستخدم ، يجب أن تكون المرشحات الصحيحة للفلوروفور في مكانها.
2. ضبط إعدادات البرنامج على المجهر متعدد الفوتونات
1. باستخدام هدف 5X ، حدد موقع الجنين. ارفع المسرح يدويا إلى أعلى موضع واستخدم التركيز الدقيق لوضع الجنين في منتصف نطاق المجهر.
2. اخفض المرحلة يدويا وقم بتغيير هدف 5X إلى هدف الغمر في الماء 25X (الفتحة العددية NA، 0.95). ارفع المسرح بعناية لإعادة الجنين إلى التركيز.
3. في البرنامج ، انقر فوق وضع "xyzt" للحصول على صور متعددة على فترات زمنية (t) في المستوى xy على عمق "z". استخدم عرض التألق السطحي أو الحقل الساطع للعثور على عمق التركيز في منطقة الاهتمام ، والتي ستحدد المكدس Z.
1. في البرنامج، انقر فوق الزر "بدء"؛ بالنسبة لهذه التجارب، كانت الحافة الجانبية للعين هي بداية المكدس Z. انقر فوق الزر "إنهاء" ؛ كان خط الوسط للجنين هو نهاية Z-stack.
ملاحظة: كان حجم الخطوة 0.3-0.6 ميكرومتر وكان هناك إجمالي ~ 200 خطوة لحجم المكدس z من 60 إلى 120 ميكرومتر).
4. انقر فوق القائمة لضبط وقت الاستحواذ وتردد التصوير.
بالنسبة للنظام الحالي، تتطلب ~ 200 خطوة حوالي 5 دقائق لكل عملية استحواذ على z-stack. من أجل التعافي الكافي من الفلوروفور وبقاء الجنين ، اسمح بنسبة لا تقل عن 1: 3 بين اكتساب z-stack (تشغيل الليزر) ووقت الاسترداد (إيقاف تشغيل الليزر).
ملاحظة: على سبيل المثال ، يتم الحصول على z-stacks كل 20 دقيقة مع 5 دقائق من اكتساب z-stack و 15 دقيقة من الاسترداد. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يمكن الحصول على مكدسات z أكبر ، ولكنها ستزيد بشكل مناسب من الوقت بين عمليات الاستحواذ على z-stack ، مما يؤدي إلى عدد أقل من الصور خلال دورة الفاصل الزمني.
1. مع الوقت المناسب لاستعادة الأجنة، اضبط الوقت بين z-stacks في النافذة المحددة. قم بتعيين المدة الزمنية الإجمالية للتجربة في النافذة المناسبة.
5. التعديلات النهائية للبرامج والليزر والجنين.
1. قم بتشغيل إعداد الصورة الحية لإجراء تعديلات نهائية على إعدادات الليزر. اضبط أشرطة التمرير بالليزر والكسب والإزاحة داخل البرنامج لتحسين صورة الفلورسنت. أيضا ، اضبط اتجاه الجنين ، حسب الحاجة ، اعتمادا على طول التجربة ، والنمو المتوقع للجنين ، وما إلى ذلك. تأكد من بقاء منطقة الاهتمام داخل الإطار طوال مدة التجربة.
2. قم بإيقاف تشغيل مصدر ضوء اللسان الفلوري حيث لم تعد هناك حاجة إليه أثناء الحصول على الفاصل الزمني. قم بتغطية المسرح بصندوق أمان الليزر (الشكل 1I). عند استخدام نظام الكشف الداخلي ، يكون صندوق أمان الليزر مناسبا للحماية من ضوء الخلفية. اضغط على "ابدأ".
ملاحظة: ومع ذلك ، مع أنظمة الكشف الخارجية الأكثر حساسية ، لا يحجب صندوق أمان الليزر إضاءة خلفية كافية ، ويلزم وجود أغطية إضافية لمنع تعطيل الحصول على الصور.
2. أثناء اكتساب الفاصل الزمني
1. أعد ملء غرفة الحمام المفتوحة بوسائط الجنين بفاصل زمني كل 8-12 ساعة (على الأقل مرتين في اليوم) أثناء الحصول على الفاصل الزمني من خلال الأبواب المنزلقة على صندوق أمان الليزر (الشكل 1I).
2. قبل فتح أبواب صندوق أمان الليزر، تأكد من أن المجهر لا يكتسب صورة بنشاط.
ملاحظة: استخدام السخانات وأنظمة الوسائط المتداولة ليس ضروريا لتجارب التصوير بفاصل زمني التي تستمر من 24 إلى 48 ساعة. في الواقع ، يصعب التحكم في درجات حرارة كل من السخانات المرحلية والمدمجة ، وأثناء الحصول على الصورة يظهر الجنين معدل نمو مناسب عند درجة حرارة تتراوح من 25 إلى 28 درجة مئوية. علاوة على ذلك ، تميل أنظمة الوسائط المتداولة إلى الفائض وربما إتلاف المعدات. وبالتالي ، يتم تنظيم جميع الأجنة بشكل روتيني بعد الاستحواذ.
3. معالجة ما بعد الاستحواذ
< نمط p = 'margin-left: 40px;'>1. في البرنامج ، انقر فوق قائمة "ملف" واختر "حفظ".
2. افتح الملف في برنامج معالجة الصور (انظر جدول المواد). قم بتمييز سلسلة الصور الصحيحة. في البرنامج ، اختر قائمة "معالجة". انقر فوق 3D Deconvolution و "تطبيق" لفك كل z-stack.
ملاحظة: الملف كبير. لذلك ، قد تستغرق هذه الخطوة عدة ساعات.
3. في البرنامج، ضمن قائمة "العملية"، انقر فوق "الحد الأقصى للإسقاط". انقر فوق "تطبيق" لبدء الحد الأقصى من الإسقاط لإنشاء صورة واحدة لكل z-stack. قم بتصدير كل ملف بحد أقصى متوقع (صورة واحدة لكل مكدس z) كملف tiff.
4. استيراد ملفات tiff الفردية إلى برنامج معالجة الفيديو. حدد جميع ملفات tiff واسحبها إلى محرر الفيديو. اضبط طول كل صورة داخل الفيديو على 0.1 ثانية. تصدير الفيديو كملف mov أو mp4.
