تصور أنماط الإسقاط المحوري للخلايا العصبية الحركية الجنينية في ذبابة الفاكهة

Abstract

المصدر: Jeong، S. تصور نمط الإسقاط المحوري للخلايا العصبية الحركية الجنينية في ذبابة الفاكهة . J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تصور الإسقاطات المحورية في ذبابة الفاكهة الأجنة. يكشف وضع العلامات المناعية للخلايا العصبية الحركية ، والتشريح الدقيق لفضح الهياكل العصبية ، والفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي بشكل جماعي عن بنية عصبية مفصلة ، مع التركيز على أنماط الإسقاط المحوري.

Protocol

1. طريقة التحضير

1. : قم بإعداد 500 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام محلول t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) عن طريق إضافة 0.5 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 0.5 مل من t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (انظر جدول المواد) إلى 500 مل من 1X PBS مع التحريك لمدة 30 دقيقة على الأقل.
2. اصنع 10 مل من 4٪ بارافورمالدهايد عن طريق إضافة 2.5 مل من محلول بارافورمالدهيد بنسبة 16٪ و 1 مل من 10x PBS إلى 6.5 مل من الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ويستخدم في غضون أسبوع واحد.
   تنبيه: تجنب ملامسة الجلد لمحلول بارافورمالدهايد لأنه شديد السمية.
3. اصنع ركيزة 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) (10٪ وزن / حجم X-Gal في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)) عن طريق إذابة 0.1 جم من ركيزة X-Gal لكل 1 مل من DMSO. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 100 ميكرولتر.
4. اصنع محلول تلطيخ X-Gal باستخدام عازلة فوسفات 10 ملي مولار (درجة الحموضة 7.2) ، و 150 ملي كلوريد الصوديوم ، وكلوريد الصوديوم ، و 1 ملي كلوريد المغنيسيوم ، و MgCl₂ ، و 3 ملي مولار من فيروسيانيد البوتاسيوم ، و K₄ [FeII (CN) ₆] ، و 3 ملي مولار من فيريسيانيد البوتاسيوم ، و K₃ [FeIII (CN) ₆] ، و 0.3٪ t-Octylphenoxypolyethoxyethanol. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام.
5. اصنع محلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ عن طريق تخفيف 30٪ من بيروكسيد الهيدروجين 1:10 بالماء منزوع الأيونات.
6. اصنع محلول 3،3 ديامينوبنزيدين (DAB) عن طريق إذابة قرص واحد (10 مجم) من DAB في 35 مل من محلول PBT الطازج. قم بالتصفية من خلال فلتر حقنة 0.2 ميكرومتر وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية في 910 ميكرولتر حصص.
   تنبيه: تخلص من جميع نفايات DAB في المبيض لتدمير DAB.
7. اصنع أطباق البيض بعصير التفاح. أضف 35 جم من أجار و 1 لتر من الماء منزوع الأيونات إلى قارورة سعة 2 لتر. أضف 33 جم من السكروز و 2 جم من تيجوسيبت و 375 مل من عصير التفاح إلى قارورة سعة 1 لتر. قم بإذابتها عن طريق التعقيم لمدة 30 دقيقة. اترك كلا المحاللين ليبردوا إلى حوالي 60 درجة مئوية. امزج هذه المحاليل واخلطها جيدا عن طريق التحريك. صب ~ 11 مل من المحلول المركب لكل طبق ثقافة 60 مم.
8. اصنع معجون الخميرة عن طريق مزج خميرة الخباز في ماء منزوع الأيونات (نسبة 1: 0.8) وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. جمع الأجنة (اليوم 1)

1. اجمع الذباب الصغير (أقل من 5 أيام) ، ولمدة 1-2 أيام ، احتفظ بها في قفص دورق بلاستيكي مع صفيحة بيض (60 مم × 15 مم) تحتوي على كمية صغيرة من معجون الخميرة في المنتصف.
2. للحصول على الجمع الأمثل للأجنة في المرحلة المتأخرة من 16 ، قم بإعداد قفص زجاجة به ذباب (> 50) في حوالي الساعة 5 مساء واتركهم يضعون البيض عند 25 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
3. انقل الذباب إلى زجاجة طعام طازجة.
4. أغلق طبق البيض بالغطاء واحتضنه رأسا على عقب عند 25 درجة مئوية في حاضنة رطبة (~ 70٪ رطوبة) طوال الليل.

3. تحضير الأجنة للتلوين المناعي (اليوم 2)

1. أضف 1.8 مل من محلول PBT إلى صفيحة البيض حوالي الساعة 10:20 صباحا واستخدم قطعة قطن لفك الأجنة من اللوحة أثناء إمالتها.
   ملاحظة: عن طريق هرس معجون الخميرة برفق باستخدام قطعة قطن ، قم بإذابتها في حالة العثور على عدد كبير من الأجنة عليها. ابدأ في جمع الأجنة ~ 40 دقيقة قبل التثبيت (حوالي الساعة 11:00 صباحا).
2. انقل الأجنة من صفيحة البويضة إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل.
3. اسمح للأجنة بالاستقرار واستنشاق محلول PBT قدر الإمكان. اشطف الأجنة مرتين ب 1 مل من محلول PBT. استنشق محلول PBT قدر الإمكان.
4. املأ الأنبوب ب 1 مل من المبيض بنسبة 50٪ (أي مخفف في الماء منزوع الأيونات) وقم بإزالة الأجنة عن طريق احتضانها على مغذيات لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
   ملاحظة: هذه الخطوة لا تقتل الأجنة منزوعة التكلل.
5. اسمح للأجنة المتكللة بالاستقرار ، واستنشق المبيض بنسبة 50٪ قدر الإمكان ، واشطف الأجنة 3 مرات باستخدام 1 مل من محلول PBT.
6. أضف 0.5 مل من الهبتان ثم أضف 0.5 مل من محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ إلى الأنبوب عند RT في حوالي الساعة 11:00 صباحا.
7. احتضان الأجنة على المغذيات لمدة 15 دقيقة في RT.
8. قم بإزالة محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ (الطبقة السفلية).
9. أضف 0.5 مل من الميثانول بنسبة 100٪ وقم بإزالة الأجنة عن طريق هز الأنبوب بقوة لمدة 30 ثانية.
10. قم بإزالة السباعي (أي الطبقة العليا).
11. أضف 0.5 مل من الميثانول بنسبة 100٪ ورج الأنبوب بقوة لمدة 10 ثوان.
12. اسمح للأجنة بالاستقرار عن طريق النقر على الأنبوب وشفط الميثانول قدر الإمكان. اشطف الأجنة ب 1 مل من الميثانول بنسبة 100٪ ، ورجها لمدة تقل عن 10 ثانية
    ملاحظة: التعرض المطول للميثانول يدمر نشاط β-Gal.
13. قم بإزالة الميثانول وشطف الأجنة المنزوعة 3 مرات باستخدام 1 مل من محلول PBT.

4. التنميط الجيني للأجنة باستخدام تلطيخ LacZ (اليوم 2)

1. أضف 1 مل من محلول PBT إلى الأنبوب واحتضان الأنبوب في كتلة حرارية 37 درجة مئوية أو حمام مائي لمدة 15 دقيقة.
2. أثناء الحضانة ، ضع محلول تلطيخ X-Gal (1 مل لكل أنبوب) عند 65 درجة مئوية في حمام مائي حتى يصبح غائما. احتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية.
3. قم بشفط محلول PBT وأضف 1 مل من محلول تلطيخ X-Gal و 20 ميكرولتر من ركيزة X-Gal إلى الأنبوب.
4. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية مع التعويذة حتى يظهر راسب أزرق.
   ملاحظة: يتراوح وقت الحضانة للموازنات الزرقاء 2 و 3 بشكل عام من 2-4 ساعات.
5. قم بإزالة محلول تلطيخ X-Gal واشطف الأجنة 3 مرات باستخدام 1 مل من محلول RT PBT.
6. باستخدام مسبار إبرة أو ملقط ، قم بفرز الأجنة يدويا من النمط الجيني المطلوب (أي الأجنة البيضاء غير الملطخة) باستخدام مجهر تشريح ضوئي (أهداف 1.6X-2.5X).
   ملاحظة: نظرا لأن بعض الموازنات الزرقاء ، مثل CyO و actin-LacZ و TM3 و actin-LacZ ، تحمل بنية معدلة وراثيا تعبر عن β-Gal البكتيرية (LacZ) تحت سيطرة الأكتين المروج ، الأجنة الملطخة باللون الأزرق بطريقة في كل مكان تحتوي على نسخة أو نسختين من كروموسومات الموازن الأزرق. لذلك ، فإن الأجنة البيضاء غير الملطخة متماثلة اللواقح للأليل القاتل المطلوب.

5. التلوين المناعي للأجنة ذات الأجسام المضادة للفاشيكلين II (اليوم 2-3)

1. اجمع ونقل أجنة النمط الجيني المطلوب (أي الأجنة البيضاء غير الملطخة) إلى أنبوب دقيق سعة 0.5 مل باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل.
   ملاحظة: في هذه الخطوة ، يمكن تنظيم الأجنة تقريبا وفقا للمعايير المورفولوجية ، بما في ذلك أنماط تجزئة البشرة وهياكل الرأس والذيل. أثناء انتفاخ الرأس ، بين 10 و 16 ساعة بعد وضع البويضات ، يخضع الجنين لانخفاض واضح في الجزء الأمامي.
2. اغسل الأجنة مرة واحدة باستخدام 0.4 مل من محلول PBT وأضف 0.3 مل من محلول الحجب (5٪ مصل الماعز العادي و 5٪ DMSO في محلول PBT).
3. قم بسد الأجنة بالتعويذة في RT لمدة 15 دقيقة.
4. أضف 75 ميكرولتر من الجسم المضاد للفاشيكلين II واحتضن الأنبوب مع التعويذة في RT طوال الليل.
5. اغسل الأجنة 4 مرات باستخدام 0.4 مل من محلول PBT لمدة 20 دقيقة على الأقل لكل غسلة.
6. أضف 0.3 مل من محلول الحجب (5٪ مصل ماعز عادي في محلول PBT) يحتوي على الجسم المضاد للبيروكسيداز المضاد للفأر والفجل الحار (2 ميكروغرام / مل) واحتضان الأنبوب مع التعويذة في RT طوال الليل.
7. اغسل الأجنة 6 مرات باستخدام 0.4 مل من محلول PBT لمدة 20 دقيقة على الأقل لكل غسلة.
8. أضف 0.3 مل من محلول DAB إلى الأنبوب.
   تنبيه: ارتد القفازات وضع جميع نفايات / أنابيب / أطراف DAB في المبيض.
9. أضف 2 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ واحتضان الأنبوب في الظلام مع التعويذة في RT حتى يتم إنتاج الكمية المطلوبة من الرواسب.
   ملاحظة: يتراوح وقت الحضانة للكيمياء النسيجية المناعية 1D4 بشكل عام من 0.5-1 ساعة.
10. اغسل الأجنة 4 مرات باستخدام 0.4 مل من محلول PBT.
    CAUTION: قم بإزالة محلول DAB وأول غسلتين بماصة وتخلص منها في المبيض.
11. أضف 0.2 مل من محلول الجلسرين / PBS المتصاعد بنسبة 70٪ إلى الأنبوب وقم بتخزينه عند RT أو 4 °C.
    ملاحظة: احتفظ بالأنبوب بعيدا عن الضوء. يمكن الحصول على مستحضرات أكثر وضوحا عن طريق وضع الأجنة في محلول 90٪ من الجلسرين / PBS. ومع ذلك ، فإن تشريح الأجنة التي تم تطهيرها في محلول الجلسرين / PBS بنسبة 90٪ أكثر من تلك التي تم تطهيرها في محلول 70٪ من الجلسرين / PBS.

6. التدريج وتشريح وتركيب وتصوير الأجنة (اليوم 4)

1. للتدريج ، انقل الأجنة المتوازنة مع 70٪ من الجلسرين / PBS على شريحة زجاجية.
2. اجمع الأجنة في المرحلة المتأخرة من 16 أجنة تحتوي على أعصاب من الأعصاب البطنية 7 (A7) و A8 و A9 (ISN) تتقارب للمس بعضها البعض و / ولها أمعاء متوسطة مقسمة إلى ثلاثة نطاقات.
   ملاحظة: يمكن تنظيم الأجنة الملطخة بالجسم المضاد 1D4 بناء على أنماط إسقاط المحاور الحركية ISN و ISNb. بعد الخروج من الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تتلاقى أعصاب A7 و A8 و A9 ISN في المرحلة المتأخرة من الأجنة 16 لتلمس بعضها البعض وتتباعد لاحقا لتمتد بعيدا إلى العضلات الظهرية (رأس السهم في الشكل 1 أ). ومع ذلك ، في منتصف المرحلة 16 من الأجنة ، تمتد أعصاب A7 ISN بالتوازي مع أعصاب A8 / A9 (قوس مربع في الشكل 1 ب). بالإضافة إلى ذلك ، فإن محاور الإسقاط لأعصاب A6 ISNb (عمودية على العضلات البطنية الجانبية) في كلا الأجزاء النصفية تتماشى تقريبا مع الطرف الخلفي للحزم المحورية الطولية للجهاز العصبي المركزي (الأسهم والخط في الشكل 1C). تختلف هذه المعايير المورفولوجية بين الأنماط الجينية المختلفة. بدلا من ذلك ، يمكن تنظيم الأجنة بناء على مورفولوجيا الأمعاء. قبل المرحلة 17 ، يكون للأمعاء الوسطى شكل يشبه القلب ، بينما تنقسم الأمعاء الوسطى إلى ثلاثة نطاقات حسب المرحلة 17.
3. تشريح الأجنة.
   1. باستخدام حقنة سعة 1 مل ، انقل كل جنين من قطرة الجلسرين وضع الجنين بطنيا لأعلى. اقطع الجزء الأمامي عند 1/4 من طول الجسم والمنطقة الخلفية الخالية من المحاور الحركية.
   2. باستخدام مسبار إبرة ، انقل الجنين المقطوع في النهاية من قطرة الجلسرين ، ولفه لتوجيهه إلى الجانب الظهري لأعلى ، وضعه أفقيا في الحقل.
      ملاحظة: عندما يتم نقل الجنين من قطرة الجلسرين ، فإن القليل من الجلسرين المرتبط بالجنين يجعله لزجا.
   3. قطع الجنين على طول خط الوسط الظهري باستخدام إبرة تنجستن واحدة دقيقة جدا. قم بعمل قطع صغير في الطرف الخلفي للجنين ثم استمر في قطع خط الوسط الظهري باتجاه الأمام. القطع في الاتجاه المعاكس جيد أيضا.
   4. باستخدام مسبار إبرة ، حرك الجنين المقطوع في خط الوسط إلى قطرة الجلسرين ، وضعه على الجانب الظهري لأعلى ، وافصل القناة الهضمية عن جدار الجسم عن طريق فتح كل جدار من جدران الجسم في اتجاه بطني جانبي (قطري) (هدف 2.5X).
      ملاحظة: تأكد من قطع خط الوسط الظهري بالكامل ، مما يؤدي إلى الفصل الكامل بين جدران الجسم الأيمن والأيسر.
   5. حرك الجنين المقطوع بخط الوسط بحذر من قطرة الجلسرين ثم ضع سوحتين من جدار الجسم لأسفل على الشريحة الزجاجية باستخدام مسبار إبرة رفيع (هدف 2.5X).
   6. باستخدام إبرة تنجستن دقيقة جدا ، قم بإزالة الأعضاء الداخلية من الجنين المقطوع عن طريق دفعها بشكل جانبي (هدف 5X).
      ملاحظة: يمكن العثور على وصف أكثر تفصيلا لإجراء تشريح آخر مماثل على الموقع.
4. للتركيب ، أضف 2-3 ميكرولتر من محلول الجلسرين / PBS بنسبة 70٪ للأجنة النظيفة والتشريح ، وباستخدام مسبار إبرة رفيعة ، قم بنقلها إلى شريحة زجاجية جديدة تم نشر 8 ميكرولتر من محلول الجلسرين / PBS بنسبة 70٪ في الوسط (هدف 2.5X).
5. ارتد غطاء (18 مم × 18 مم). أغلق حواف الغطاء بطلاء أظافر عادي (سواء كان واضحا أو ملونا جيدا).
6. التقط صورا بدقة عالية (أهداف غمر الزيت 20X و 40X و 63X) تحت مجهر ضوئي لتباين التداخل التفاضلي (DIC) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: يمكن إنتاج تصور أفضل وتوصيف النمط الظاهري ، خاصة بالنسبة لمحاور محرك ISNb ، باستخدام هدف غمر الزيت 63X.

Results

الشكل 1: تحديد مراحل الأجنة بناء على أنماط الإسقاط للمحاور الحركية ISN و ISNb. ( أ) في المرحلة المتأخرة من 16 أجنة من النوع البري ، تتلاقى أعصاب A7 و A8 و A9 ISN (الأسهم) للمس بعضها البعض (رأس السهم). الأمامي يسار والبطني لأسفل. شريط المق...

Materials