التصوير في الجسم الحي لدماغ يرقات الزرد لتصور الخلايا العصبية المخيخية

الملخص

المصدر: Schramm, P. et al. تصوير في الجسم الحي لأنسجة المخ النشطة بالكامل في يرقات أسماك الزرد المستيقظة والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو التصوير في الجسم الحي للخلايا العصبية المخيخية في يرقات الزرد المعدلة وراثيا ، والتي تعبر عن البروتينات الفلورية في الخلايا العصبية بركنجي. تتضمن العملية تخدير اليرقات ، وتثبيتها في الاغاروز ، وإزالة الجلد المصطبغ بعناية لتعزيز تغلغل الضوء وشدة التألق. أخيرا ، يتم تصوير العينات المحضرة تحت مجهر متحد البؤر لتصور الخلايا العصبية المسماة بوضوح.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تخدير اليرقات والاستعدادات للتضمين
   1. عند بدء التجربة لهذا اليوم ، انقل المطلوبة بماصة باستور بلاستيكية إلى طبق بتري بقطر 90 مم ، والذي يتم ملؤه إما ب Danieau (لليرقات التي لا تزال محفوظة في طبق بتري مع Danieau) أو الماء من منشأة الأسماك (لليرقات التي يزيد عمرها عن 7 أيام بعد الإخصاب [dpf] ويتم الاحتفاظ بها في منشأة الأسماك).
      1. عند سحب الأسماك التي يزيد عمرها عن أسبوعين ، تأكد من أن فتحة الماصة كبيرة بما يكفي لتجنب إصابة الأسماك عند نقلها. لا تستخدم شبكة لأنها ستلحق الضرر الجسدي بالأسماك ، وخاصة اليرقات الأصغر سنا.
   2. أضف نوبلي روتيفيرا أو أرتيميا مناسبة لحجم اليرقات المحفوظة في طبق بتري لضمان الوصول المجاني إلى الطعام والحالة الصحية القصوى لليرقات وتقليل الإجهاد.
   3. للتضمين ، انقل اليرقات المختارة إلى طبق بتري بقطر 35 مم مملوء بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF). أضف الحجم اللازم من d-Tubocurarine للوصول إلى تركيز العمل / جرعة فعالة من 10 ميكرومتر وانتظر لبضع دقائق حتى يتم تثبيت اليرقات تماما.
      ملاحظة: عندما تكبر الأسماك أو إذا كانت هناك حاجة إلى تخدير كامل أسرع (أقل من 5 دقائق) ، فمن الممكن زيادة تركيز d-Tubocurarine (LD50 للفئران هو 0.13 مجم / كجم عن طريق الوريد). من الممكن أيضا استخدام مخدر مختلف ، مثل α-bungarotoxin (تركيز العمل: 1 مجم / مل) ، والذي له نفس تأثير curare ويحافظ أيضا على نشاط الدماغ بشكل كامل. إذا لم يكن الدماغ النشط بالكامل ضروريا للموضوع محل الاهتمام ، فإن التريكايين بجرعة غير مميتة (0.02٪) هو أيضا خيار لتخدير اليرقات بالكامل. ومع ذلك ، فإن التريكائين يمنع قنوات الصوديوم ، مما يضعف نشاط الدماغ.
   4. قم بإعداد حجرة التثبيت عن طريق أخذ غطاء طبق بتري بقطر 35 مم ، واقلب الغطاء رأسا على عقب ، وضع غطاء زجاجي مربع (24 × 24 مم) في الجزء السفلي من الغطاء. انظر الشكل 1 (الجزء العلوي) للحصول على وصف تخطيطي لهذه الخطوات. يمنع السطح الأكثر نعومة للزجاج الانزلاق بعيدا عن كتلة الاغاروز التي تحتوي على اليرقات أثناء إجراء فتح الجمجمة.
   5. قم بتحديد كمية ACSF اللازمة لليوم في قارورة مناسبة (على سبيل المثال ، أنبوب 50 مل ، دورق ، زجاجة شوت ، إلخ) وأكسجها بالكربوجين (5٪ CO₂ ، 95٪ O₂). إذا كان التصوير مورفولوجيا فقط (على سبيل المثال ، أنماط التألق) ، فإن ACSF لا يزال ضروريا لضمان سلامة الدماغ وأن الخلايا لا تتأثر سلبا بتأثيرات الأسمولية ولكن ليست هناك حاجة إلى أكسجة ACSF. يجب تنفيذ هذه الخطوة فقط عندما يكون نشاط الدماغ الكامل ضروريا للتصوير.
      ملاحظة: للحصول على تشبع الأكسجين الأمثل للوسط ، أضف حجر هواء إلى نهاية أنبوب الكربوجين. لضمان مستوى عال بدرجة كافية من الأكسجين ، من الضروري استبدال ACSF في غرف التصوير مع ACSF المؤكسج حديثا كل 20-60 دقيقة ، اعتمادا على عدد وعمر اليرقات المضمنة في نفس غرفة التصوير (على سبيل المثال ، يكفي تبادل ACSF واحد مدمج كل ساعة. بالنسبة لست يرقات أقدم من 14 نقطة في الدقيقة المضمنة بالتوازي ، من الضروري تبادل ACSF كل 20 دقيقة) لذا خطط للكمية اللازمة من ACSF المشبع بالأكسجين وفقا للتجربة المخطط لها.
2. تضمين اليرقات<ol style='list-style-type:decimal;'>
3. انقل اليرقات المخدرة بالكامل باستخدام ماصة باستور بلاستيكية إلى غرفة التركيب المعدة (في الخطوة 1.4). بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط الزائد بعناية لتجنب تخفيف الاغاروز ذوبان منخفض (LM). يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية تحت مجهر استريو مع تكبير كاف.
   ملاحظة: يمكن أن يساعد إمالة حجرة التركيب في إزالة الوسيط بالكامل.
4. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية ، عن طريق إضافة قطرة LM-agarose كبيرة بما فيه الكفاية فوق اليرقات (حوالي 1 مل ، اعتمادا على حجم اليرقات) لحماية من الجفاف وتقليل الإجهاد غير الضروري.
5. قم بتوجيه اليرقات في موضعها قبل أن تصلب الاغاروز. تأكد من توجيه الجزء الظهري من اليرقات لأعلى. تأكد أيضا من تضمين اليرقات بالقرب من سطح الاغاروز قدر الإمكان.
   NOTE: اعتمادا على حجم وعدد اليرقات المخطط لتضمينها في نفس الوقت ، من الممكن ضبط تركيز الاغاروز. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 1-3 يرقات يبلغ عمرها 30 نقطة في الدقيقة ، يوصى بتركيز 1.8٪ -2٪ LM-agarose. بالنسبة ل 1-4 يرقات عمرها 7 dpf ، فمن الأكثر عمليا استخدام 2.5٪ LM-agarose ، بينما بالنسبة ل 5-8 يرقات ، يكون 2٪ أكثر ملاءمة. إذا كانت هناك حاجة إلى دماغ نشط بالكامل ، فمن المستحسن تضمين ثلاث أسماك فقط في نفس الوقت لتقليل الوقت اللازم لتشغيل اليرقات. بشكل عام ، يوصى باستخدام تركيزات أقل (1.8٪ -2٪) كلما تقدمت اليرقات في السن ، أو من المخطط دمج المزيد من اليرقات في نفس الوقت.
6. إذا تم تسجيل الصور باستخدام مجهر مقلوب ، فقم بقص كتلة الاغاروز التي تحتوي على اليرقات إلى شكل متوازي المستطيلات الصغير. هذا مهم لنقل اليرقات إلى غرفة التصوير لاحقا. في حالة استخدام مجهر عمودي ، فإن هذا التشذيب ليس ضروريا ، لأنه يمكن أيضا استخدام غرفة التثبيت كغرفة تصوير. في الشكل 1 (الجزء العلوي) ، يمكن للمرء أن يجد وصفا تخطيطيا لهذه الخطوات.

تعريض الدماغ
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية بعناية فائقة حتى لا تؤذي اليرقات دون داع. إذا كانت هناك حاجة إلى دماغ نشط بالكامل للتجربة ، فضع في اعتبارك أنه مع كل ثانية تمر ، بينما لا تزال السمكة مثبتة بالكامل في الاغاروز ولها جمجمة مفتوحة بدون ACSF مؤكسج ، سيعاني الدماغ من نقص الأكسجين ويجف. ستصبح آثار نقص الأكسجين أكثر دراماتيكية كلما تقدمت اليرقات المضمنة. لذلك ، من المهم إجراء الجراحة ليس فقط في أقصر وقت ممكن ، ولكن أيضا بأقصى قدر من الدقة لتجنب تلف الدماغ الميكانيكي بالإبرة. يجب ألا تستغرق الخطوات 3.2-3.4 أكثر من 30 ثانية لكل سمكة عند التدريب.

ابدأ الجراحة بمجرد أن تصلب الاغاروز. أولا ، قم بقص كل الأغروز الزائد فوق منطقة الدماغ ذات الأهمية للحصول على وصول مجاني إلى الرأس ومساحة عمل واضحة. إذا كان الجزء الظهري من الرأس يخرج بالفعل من الاغاروز ، فتخط هذه الخطوة.

اعتمادا على منطقة الاهتمام ، اختر مكانا لبدء الجراحة. خذ الإبرة الزجاجية وقم بعمل شق صغير عبر الجلد دون اختراق الأنسجة بعمق شديد. ستكون هذه هي نقطة البداية لتقشير الجلد المتراكب.
NOTE: للحصول على أفضل النتائج ، لا تبدأ أبدا مباشرة فوق المنطقة المعنية لتقليل مخاطر إتلاف الهياكل المهمة. إذا لزم الأمر ، من الممكن البدء في الجزء الخلفي من الدماغ الخلفي والعمل إلى الأمام حتى يتم تقشير المنطقة غير المرغوب فيها من الجلد.

استمر في إجراء جروح صغيرة جدا على طول جزء الجلد ، بهدف إزالتها بصعوبة تحريك الإبرة أسفل السطح مباشرة. في معظم الأحيان ، ليس من الضروري التحرك بالكامل حول الدماغ وقطع قطعة تشبه الدائرة من الجلد والجمجمة ، ولكن بدلا من ذلك قم فقط بعمل شقين على طول الرأس ثم دفع الجلد بعيدا إلى جانب أو آخر. يوضح الشكل 2 تمثيلا تخطيطيا لاستراتيجية القطع المثلى للحصول على وصول مجاني إلى المخيخ.
NOTE: هذه الجراحة المجهرية هي إجراء دقيق ، وستحتاج على الأرجح إلى بعض التدريب لإزالة الجلد بشكل مثالي دون الإضرار بالدماغ الأساسي. من المستحسن أيضا العثور على استراتيجية القطع المثلى لمنطقة الدماغ ذات الاهتمام والتمسك بها طوال مدة التجربة.

مباشرة بعد إزالة الجلد من جميع اليرقات المضمنة ، اسكب ACSF (المؤكسج) فوق الاغاروز لإغراق جزيئات الجلد والدم غير المرغوب فيها ، والحفاظ على الدماغ نشطا تماما ، وحمايته من الجفاف.
ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى دماغ سليم للتجربة ، فمن المستحسن الذهاب إلى ثلاث أسماك كحد أقصى في المرة الواحدة.

إذا كنت تستخدم مجهر مستقيم ، فابدأ مباشرة بالتصوير.

1. عند استخدام مجهر مقلوب ، حرك ملعقة صغيرة أسفل كتلة الاغاروز متوازية المستطيلات (الخطوة 2.4).
2. أضف قطرة صغيرة من LM-agarose إلى قاع غرفة التصوير (على سبيل المثال ، طبق ذو قاع زجاجي) واقلب على الفور كتلة الاغاروز التي تحتوي على اليرقات بالملعقة لمدة 180 درجة وادفعها برفق إلى أسفل غرفة التصوير ، بينما تعمل قطرة الاغاروز السائلة كغراء.
3. عندما يتجمد الاغاروز ، املأ غرفة التصوير ب ACSF (المؤكسج) ، ثم ابدأ في التصوير. انظر الشكل 1 (الجزء السفلي) للحصول على وصف تخطيطي.

عندما يكون نشاط الدماغ الكامل مطلوبا للتجربة ، تأكد دائما من أن ACSF في غرفة التصوير يحتوي على مستوى أكسجين مرتفع بما فيه الكفاية. لضمان ذلك ، يجب استبدال الوسط بعناية مع ACSF المؤكسج حديثا كل 20-60 دقيقة (اعتمادا على عدد وحجم الأسماك ، وحجم وسطح غرفة التصوير ، ومدة التصوير).

النتائج

الشكل 1: إجراء تخطيطي لإعداد سمك الزرد المفتوح للجمجمة في الجسم الحي بطريقة تدريجية. يمكن العثور على تعليمات العمل للخطوات المختلفة في الرسم نفسه. رسم من تصميم فلوريان هيتش ومقتبس من قبل بول شرا...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> confocal قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات laser scanningmicroscope LeicaTCS SP8 d-TubocurareSigma-AldrichT2379-100MG زجاج شعري من النوع 1WPI1B150F-4 زجاج شعري من النوع 2جهاز هارفاردGC100F-10 غطاء زجاجيدلتالابغرفة تصوير D102424 نفس المرجعنفسه LM-Agarose Condalab8050.55 كاميرا مجهرلايكاDFC9000 GTC مجتذب إبرة من النوع 1NARISHIGEنموذج PC-10 مجتذب إبرة من النوع 2أدوات Sutterموديل P-2000 Pasteur-Pipettes 3mlA.Hartenstein20170718 TricainSigma-AldrichE10521-50G 35 مم طبق بتريSarstedt833900 90 مم طبق بتريSarstedt821473001