توصيف الخواص الميكانيكية لأنسجة دماغ الفئران باستخدام مجهر القوة الذرية

الملخص

المصدر: كانوفيتش ، إي بي ، وآخرون . توصيف الخواص الميكانيكية متعددة النطاقات لأنسجة المخ باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية ، والمسافة البادئة للتأثير ، وقياس الروماتير. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) لقياس الخصائص اللزجة المرنة لأنسجة المخ ، حيث يتفاعل ناتئ مع مسبار كروي مع الأنسجة وينحني تحت القوى المطبقة. يتتبع شعاع الليزر المنحرف على الكاشف الكابولي لقياس عمق المسافة البادئة واسترخاء القوة ، مما يسمح بتوصيف الخصائص الميكانيكية للأنسجة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. المسافة البادئة الممكنة بمجهر القوة الذرية (AFM)

1. قم بإعداد أطباق بتري بقطر 60 مم (P60) بمادة لاصقة حيوية مشتقة من بلح البحر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   1. قم بتحميل مسبار AFM بعناية بثابت زنبركي اسمي يبلغ 0.03 نيوتن / م وحبة بورسليكات قطرها 20 ميكرومتر في حامل المسبار.
   2. قم بمعايرة ثابت الزنبرك وحساسية الرافعة البصرية العكسية (InvOLS) لناتئ AFM باستخدام طريقة الضبط الحراري.
      ملاحظة: بمجرد حساب ثابت الزنبرك لمسبار AFM ، يجب أن يظل ثابتا مع الاستخدام المتكرر. ومع ذلك ، سيحتاج InvOLS الكابولي إلى إعادة معايرة في كل مرة يتم فيها إعادة محاذاة الليزر مع الكابولي. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء المعايرة على ركيزة أكثر صلابة من الكابولي بعدة أوامر من حيث الحجم ، مثل البوليسترين.
   3. قم بتشغيل السخان المثبت على المسرح واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
   4. قم بتركيب شريحة الدماغ على أطباق P60.
      1. صب برفق شريحة دماغ بسمك 350 ميكرومتر ووسط مستقل عن ثاني أكسيد الكربون (CO₂) من القارورة المستديرة القاعية في طبق P60 مغطى بمادة لاصقة حيوية مشتقة من بلح البحر.
      2. ضع شريحة الدماغ في وسط طبق P60 عن طريق إمالتها برفق. إذا لزم الأمر ، قم بسحب الوسط ببطء من الماصة اليدوية لتكشف شريحة دماغية مطوية على نفسها ، أو الأفضل من ذلك ، ضع شريحة الدماغ في وسط الطبق.
      3. قم بإزالة الوسائط الزائدة بعناية باستخدام ماصة P1000 (لا تستخدم المكنسة الكهربائية).
      4. ضع غطاءا على طبق P60 واترك شريحة الدماغ تلتصق لمدة 20 دقيقة.
   5. قم بإزالة رأس AFM ، ضع شريحة الدماغ المثبتة في طبق P60 على مرحلة AFM ، وأضف ~ 2 مل من الوسط المستقل عن ثاني أكسيد الكربون₂ الدافئ مسبقا.
   6. أضف بعناية قطرة من الوسائط إلى مسبار AFM لحمايتها من الانكسار بسبب التوتر السطحي عند إنزالها في الوسائط المحيطة بشريحة الدماغ.
   7. أعد وضع رأس AFM على المسرح وابدأ في خفض الرأس حتى يتم غمره في الوسائط.
   8. باستخدام كاميرا الجهاز المقترن بالشحن (CCD) ذات الرؤية العلوية ، أعد وضع الليزر على الكابولي.
      ملاحظة: ستتغير محاذاة الليزر على الكابول بشكل طفيف بسبب الاختلاف في معامل الانكسار للهواء والوسيط.
   9. انتظر 5 دقائق حتى يتكيف الكابول مع غمره في سائل دافئ ، ثم أعد ضبط محاذاة المرآة على انحراف حر يبلغ 0 فولت.
   10. قم بتشغيل طيف حراري على مسبار AFM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم ملاءمة الذروة الحرارية الأولى لإعادة حساب InvOLS الخاص بمسبار AFM في الوسائط.
   11. باستخدام المجهر البصري ، حرك مرحلة العينة بحيث تكون منطقة الدماغ محل الاهتمام أسفل مسبار AFM. ملاحظه: سيظهر الجسم الثفني مظلما لأنه أكثر غموضا من المادة الرمادية المحيطة. القشرة تتفوق على الجسم الثفني.
   12. أعد ضبط محاذاة المرآة إلى انحراف حر يبلغ 0 فولت.
   13. في مقياس المجموع والانحراف في برنامج AFM ، انقر فوق "إشراك" لإشراك رأس AFM.
   14. باستخدام قرص الموضع الموجود على رأس AFM ، اخفض الرأس حتى يتم التلامس بين الكابولي والعينة.
2. إجراء تجارب الامتثال الزحف.
   1. إنشاء دالة قوة مطبقة في محرر وظائف البرنامج. تتكون وظيفة القوة من منحدر مدته 0.1 ثانية إلى نقطة محددة تبلغ 5 نانوتن والاحتفاظ بها لمدة 20 ثانية ، متبوعا بمنحدر مدته ثانية واحدة إلى قوة مطبقة قدرها 0 نانوتن.
      1. في اللوحة الرئيسية للمسافة البادئة، ضمن طريقة المسافة البادئة، حدد "تحميل" لوضع المسافة البادئة، و"N" للوحدات، و"محرر الوظائف" لوظيفة Indenter.
      2. في محرر الوظائف ، في لوحة Segment Parms ، قم بإنشاء مقطع دالة قوة مطبقة يبدأ عند 0 nN وينتهي عند 5 nN ، بزمن 0.1 ثانية. انقر فوق "إدراج -->".
      3. بالنسبة للمقطع التالي ، اضبط البداية على 5 نانوتن ، والنهاية على 5 نانوتن ، والوقت على 20 ثانية. انقر فوق "إدراج -->".
      4. بالنسبة للمقطع الأخير ، اضبط البداية على 5 نانوتن ، والنهاية على 0 نانوتن ، والوقت على 1 ثانية. ثم انقر فوق "رسم" وأغلق نافذة محرر الوظائف.
   2. في علامة التبويب Force في اللوحة الرئيسية ، حدد "منحدر indenter بعد الزناد" واضبط وظيفة القوة المطبقة على التشغيل بعد الوصول إلى نقطة تشغيل تبلغ 0.1 فولت.
   3. انقر فوق "قوة واحدة" في الجزء السفلي من علامة تبويب Force في اللوحة الرئيسية ، والتي ستؤدي إلى تشغيل وظيفة القوة المطبقة المبنية للتوافق مع الزحف.
   4. بعد الانتهاء من المسافة البادئة للقوة المفردة ، ارفع رأس AFM بحيث يكون بعيدا عن ملامسة العينة. ثم أعد تعشيق الرأس وأعد الانحراف الحر.
   5. قم بتغيير موضع مرحلة العينة لتحديد منطقة اهتمام جديدة وخفض رأس AFM لإجراء اتصال. ملاحظه: يجب سحب رأس AFM من سطح العينة عند تحريك مرحلة العينة. يمكن أن يؤدي عدم القيام بذلك إلى تلف ناتئ AFM الدقيق.
   6. كرر الخطوات حتى يتم جمع الكمية المطلوبة من البيانات.
3. إجراء تجارب استرخاء القوة.
   1. قم بإنشاء دالة المسافة البادئة المطبقة في محرر وظائف البرنامج. تتكون وظيفة المسافة البادئة من منحدر مدته 0.1 ثانية إلى نقطة محددة تبلغ 3 ميكرومتر والاحتفاظ بها لمدة 20 ثانية ، متبوعا بمنحدر مدته ثانية واحدة إلى عمق مسافة بادئة يبلغ 0 ميكرومتر.
      1. في اللوحة الرئيسية للمسافة البادئة ، ضمن طريقة المسافة البادئة ، حدد "المسافة البادئة" لوضع المسافة البادئة ، و "m" للوحدات ، و "محرر الوظائف" لوظيفة Indenter.
      2. في محرر الوظائف ، في لوحة Segment Parms ، قم بإنشاء مقطع دالة القوة المطبقة يبدأ من 0 ميكرومتر وينتهي عند 3 ميكرومتر ، مع وقت 0.1 ثانية. انقر فوق "إدراج -->".
      3. بالنسبة للمقطع التالي ، اضبط البداية على 3 ميكرومتر ، والنهاية على 3 ميكرومتر ، والوقت على 20 ثانية. انقر فوق "إدراج -->".
      4. بالنسبة للجزء الأخير ، اضبط البداية على 3 ميكرومتر ، والنهاية على 0 ميكرومتر ، والوقت على 1 ثانية. ثم انقر فوق "رسم" وأغلق نافذة محرر الوظائف.
   2. في علامة التبويب Force في اللوحة الرئيسية ، حدد "منحدر indenter بعد الزناد" واضبط وظيفة القوة المطبقة على التشغيل بعد الوصول إلى نقطة تشغيل تبلغ 0.1 فولت.
   3. انقر فوق "قوة واحدة" في الجزء السفلي من علامة تبويب القوة في اللوحة الرئيسية لتشغيل وظيفة المسافة البادئة المطبقة لإنشاء لتخفيف القوة.
   4. بعد الانتهاء من المسافة البادئة أحادية القوة ، ارفع رأس AFM بحيث يكون بعيدا عن ملامسة العينة ، ثم أعد تعشيق الرأس وأعد الانحراف الصفر.
   5. أعد وضع المسرح لتحديد منطقة اهتمام جديدة وخفض الرأس لإجراء اتصال.
   6. كرر كلا القياسين حتى يتم جمع الكمية المطلوبة من البيانات.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Hibernate-A متوسطGibcoA1247501ثاني أكسيد الكربون₂ - وسط عصبي مستقل للأنسجة البالغةمجهر القوة الذرية ، MFP-3D-BIOAsylum Research - سخان أطباق Petriأبحاث اللجوء- مسبار AFM ، 0.03 نيوتن / م ، كرة البورسليكات نصف قطرها 10 ميكرومترنوفاسكانPT. GS Cell-TakCorning354240 لاصق حيوي مشتق من بلحالبحر بيكربونات الصوديومSigma-AldrichS5761يمكن استخدام الموردين البديلينهيدروكسيد الصوديوم ، يمكن استخدامالموردين البديلين 1N Sigma-Aldrich59223C