قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترن بالحث بالليزر لتصور المعادن في أنسجة دماغ الفئران

الملخص

المصدر: هير ، دي جيه ، et.al. تصوير المعادن في أنسجة المخ عن طريق الاستئصال بالليزر - البلازما المقترنة بالحث - قياس الطيف الكتلي (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو استخدام الاستئصال بالليزر - قياس الطيف الكتلي بالبلازما المقترنة بالحث (LA-ICP-MS) لتصور وقياس توزيعات المعادن في أنسجة دماغ الفئران. يتضمن البروتوكول الاستئصال بالليزر لتوليد رذاذ من جزيئات العينة ، وتأين الجسيمات في البلازما ذات درجة الحرارة العالية ، وقياس الطيف الكتلي لفصل الأيونات بنسب الكتلة إلى الشحنة. ثم يتم استخدام البرامج المتخصصة لإنشاء صور كمية ، تكشف عن التوزيع المكاني للمعادن داخل الأنسجة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. إعداد LA-ICP-MS للتحليل

1. وضع المعايير والعينة في غرفة الاستئصال، مع التأكد من أنها تقع ضمن عمق مجال كاميرا CCD المزودة بوحدة LA. إذا كان ضبط الأداة ضروريا ، فقم بتضمين مادة مرجعية مناسبة ( على سبيل المثال ، NIST 612 العناصر النزرة في الزجاج). شد المسمارين الموجودين على باب الغرفة بإصبع لإغلاق غرفة الاستئصال.
2. في برنامج ICP-MS، حدد فتح صمام غاز الأرجون في لوحة "الصيانة" أو اللوحة المماثلة واضبط تدفق الغاز الناقل على 1.2 لتر دقيقة ^-1 في مربع الحوار المناسب.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام الأرجون كغاز ناقل. تستخدم العديد من الأمثلة إما الهيليوم أو خليط من الهيليوم والأرجون كغاز ناقل.
3. في برنامج LA ، انقر فوق الزر "تطهير" لشطف الخلية بغاز الأرجون لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   } ملاحظة: يمكن تغيير وقت التطهير بالنقر فوق "وقت التطهير" أو زر مشابه. عند استخدام نظام استئصال مع خلية استئصال ثنائية الحجم ، انقل المرحلة بشكل دوري إلى كل زاوية واجتاز الخلية قطريا لضمان إزالة أكبر قدر ممكن من الهواء المتبقي من الخلية. يمكن تحقيق ذلك عن طريق تحديد "المراحل الرئيسية" أو الوظيفة المكافئة.
4. قم بتشغيل برنامج المقارنات الدولية - MS بالنقر فوق "تشغيل البلازما" واتركه للإحماء لمدة ساعتين ، يمكن خلالها تنفيذ الخطوات من 1.5 إلى 2.4. تختلف إعدادات الجهاز بين الشركات المصنعة.
5. الاستئصال التمثيلي لمعايير الأنسجة
   1. حدد أداة الخط وارسم خطا واحدا من الاستئصال بطول 3 مم تقريبا عبر سطح الأنسجة.
   2. قم بتعيين المعلمات على النحو التالي عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن فوق خط الاستئصال في قائمة التجارب وتغيير ما يلي: قطر الحزمة (يتم تحديده حسب الاقتضاء من قبل المستخدم ؛ يتم استخدام شعاع مربع 30 ميكرومتر هنا) ، وسرعة المسح (4 أضعاف قطر الحزمة في الثانية ؛ 120 ميكرومتر ثانية ^-1 }) وطلاقة الطاقة (0.3 -0.5 J cm ^-2 للأنسجة الرخوة ؛ التحسين إذا لزم الأمر للمصفوفات الأكثر صلابة). عند سمك الأنسجة 30 ميكرومتر ، لا يخترق شعاع الليزر السماكة الكاملة لهذا النسيج ، مما يزيل أي ملوث محتمل من دعامة المجهر. يمكن استخدام التطبيع إلى الكربون لتصحيح التباين في كمية الأنسجة المستعصية. قم بتعيين هذه المعلمات كإعداد افتراضي لكل سطر لاحق عن طريق تحديد زر الاختيار "الافتراضي".
   3. كرر هذا السطر ست مرات عن طريق تحديد السطر الأولي والنقر بزر الماوس الأيمن وتحديد "عمليات المسح المكررة". تأكد من إزاحة الخطوط إما في المحور x- أو y- بواسطة قطر الحزمة. هذا يعطي ما مجموعه سبعة خطوط لكل معيار ، متباعدة وفقا لقطر الحزمة.
   4. كرر الخطوات 1.5.1 - 1.5.3 لكل معيار ، مع ضمان الخط المتطابق بالطول.
6. لرسم منطقة الاستئصال فوق العينة ، اتبع إحدى الطريقتين التاليتين:
   ملاحظة: تأكد من استخدام نفس معلمات المسح (قطر الحزمة ، سرعة المسح ، طلاقة الطاقة) لخطوط العينة.
   1. إذا كان نظام LA مزودا بمجال رؤية واسع ، فحدد أداة الخط وارسم خطا من الزاوية العلوية اليسرى للعينة لفترة كافية لتغطية العينة في أوسع نقطة لها باستخدام نفس معلمات الليزر الموضحة في 1.5. قم بتكرار هذا المسح كما هو موضح في 1.5.3 مع تباعد الخطوط وفقا لقطر الحزمة عدة مرات حسب الضرورة لضمان التغطية الكاملة للعينة.
   2. إذا لم يكن عرض المجال الواسع متاحا، فحدد وإحداثيات x و{y (التي تظهر عادة على الشاشة الرئيسية باسم "موضع المرحلة" أو ما شابه ذلك) المقابلة لزوايا المستطيل التي تغطي العينة بأكملها. استخدم هذه الإحداثيات لوضع خطوط الاستئصال المتوازية التي تغطي منطقة العينة بأكملها.
   3. ارسم خطوطا للمسح المتقطع للمعايير على أبعد تقدير بعد ~ 20 ساعة من مسح العينة عن طريق تكرار العملية الموضحة في 1.5. اعتمادا على مدة فحص العينة ، قد يكون هذا مطلوبا عدة مرات. قم بإنهاء التجربة بمسح إضافي للمعايير.
      ملاحظة: عند تحديد إحداثيات x و y أثناء تطهير الخلية ، فإن تحديد المواضع الرئيسية والمعايرة المرتبطة بالمحور سيغير التفاصيل المكتسبة مسبقا لإحداثيات x و y بينما لن يتأثر الفرق ( أي طول السطر).

2. إعداد طرق الحصول على البيانات ل ICP-MS

1. بالنسبة لخط الاستئصال القياسي ، اقسم طول الخط على سرعة المسح بالليزر لتحديد إجمالي وقت التحليل لسطر واحد. كرر هذا لسطر العينة.
2. في برنامج ICP-MS ، قم بإنشاء طريقة جديدة (كما هو موضح هنا ك "دفعة") وتأكد من تحديد "تحليل حل الوقت" أو ما يعادله. حدد قيم m/z المراد اكتشافها، ثم اضبط وقت التكامل لكل m/z بحيث يساوي إجمالي وقت التكامل لدورة واحدة 0.25 ثانية. انقر فوق "حفظ الدفعة باسم" وقم بالاسم وفقا لذلك ( على سبيل المثال، Std1).
   ملاحظة: نظرا لأن العينة ستعبر شعاع الليزر بأربعة أضعاف قطر الحزمة ، فإن هذا يضمن تسجيل نقطة بيانات لكل كتلة تعادل قطر الحزمة. على سبيل المثال ، باستخدام حجم بقعة 100 ميكرومتر ، ستنتج سرعة المسح 400 ميكرومتر ثانية ^-1 مع وقت تكامل يبلغ 0.25 ثانية صورا بأحجام بكسل حقيقية. يمكن تعديل وقت التكامل لتحسين الحساسية ؛ عند زيادة وقت التكامل إلى 0.33 ثانية ، يجب إبطاء سرعة المسح إلى ثلاثة أضعاف قطر الحزمة.
3. بالنسبة للمعايير ، أدخل وقت التحليل لكل مسح خطي في المربع المناسب ، بالإضافة إلى 15 ثانية إضافية لحساب أوقات الإحماء والغسيل بالليزر. أدخل قائمة تشغيل نموذجية ( أي الترتيب الذي يتم به تشغيل عمليات الفحص) بنفس عدد عمليات الاستحواذ (عادة ما يتم ترقيمها بالتتابع; أي 001 ، 002 ، وما إلى ذلك ) كإجمالي عدد الأسطر القياسية.
4. بالنسبة للعينة، قم بتكرار الطريقة المستخدمة للمعايير عن طريق حفظ الطريقة أو الدفعة الحالية باسم ملف بديل، واضبط إجمالي وقت الاستحواذ (بما في ذلك 15 ثانية إضافية) والعدد الإجمالي لعمليات الاستحواذ لمطابقة عدد الأسطر التي ستقوم باستبعاد العينة.
   ملاحظة: نظرا لأن معظم أنظمة LA-ICP-MS تستخدم مشغلا أحادي الاتجاه (يقوم LA بتشغيل ICP-MS) ، فمن الضروري أن ينتظر برنامج ICP-MS المشغل من LA قبل بدء خط الاستئصال اللاحق. ستقرأ نافذة الاستحواذ على برنامج المقارنات الدولية "في انتظار البدء".

3. تشغيل التجربة

1. ابدأ قائمة انتظار ICP-MS عن طريق إضافة الطريقة أو الدفعة الأولى إلى قائمة الانتظار وتأكد من أن البرنامج ينتظر المشغل من نظام LA.
2. في برنامج LA ، قم بتمكين مصدر طاقة الليزر بالنقر فوق "انبعاث" ، والنقر فوق "تشغيل" واضبط وقت التسخين بالليزر على 10 ثوان ووقت الغسيل على 20 ثانية في الصناديق المناسبة.
   ملاحظة: سيضمن هذا التجاوز أن يكون برنامج المقارنات الدولية (ICP-MS) جاهزا لبدء الحصول على بيانات جديدة عندما يبدأ الليزر في كل خط لاحق من الاستئصال.
3. ابدأ تسلسل الليزر بالنقر فوق "ابدأ". في حالة استخدام خلية ذات حجمين ، تأكد من أن كوب العينة في موضعه.

4. حساب معايير الكمية

ملاحظة: هناك العديد من الاختلافات لتحويل بيانات ICP-MS إلى صور. وتشمل هذه استخدام أدوات برمجية محلية الصنع مكتوبة بلغات مفتوحة المصدر ووحدات ماكرو تجارية وبرامج تحليل البيانات. هنا ، استخدم المكون الإضافي للبرنامج الذي تم تطويره مؤخرا ، استنادا إلى مجموعة تحليل بيانات LA-ICP-MS المتخصصة.

1. انقل جميع المجلدات الدفعية التي تحتوي على بيانات التشغيل (001.d ، 002.d ، وما إلى ذلك .) إلى كمبيوتر منفصل مثبت عليه برنامج التحليل. استخرج ملفات البيانات * .csv لكل سطر من الدفعة في مجلد منفصل.
   ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام برنامج نصي لنقل ملفات *.csv تلقائيا إلى مجلد جديد. راجع كود Python المرفق لمزيد من التفاصيل. تمت كتابة هذا البرنامج النصي ليناسب Agilent 7700 أو 8800 Series ICP-MS ولكن يمكن تحريره ليناسب ملف الإخراج من الشركات المصنعة الأخرى.
2. افتح النظام الأساسي للبرنامج واتبع علامات التبويب بالتتابع لاستيراد المعايير وتحليلها لإنتاج صور كمية كما هو موضح أدناه.
3. لاستيراد البيانات من الدفعة القياسية الأولى ، حدد "Agilent .csv" ل "نوع الملف" ، و "المجلد بأكمله" ل "نوع الاستيراد" وتحقق من أن "تنسيق التاريخ" مطابق لتنسيق الكمبيوتر. انقر فوق "استيراد"، وحدد المجلد الذي يحتوي على ملفات .csv للمجموعة الأولى من المعايير، وانتقل إلى علامة التبويب "الخطوط الأساسية".
4. طرح الأساس
   1. استخدم علامة التبويب "التحديدات التلقائية" (الأمر 2) من القائمة المنسدلة للتطبيق الرئيسي في شريط الأدوات، وحدد "معلومات من الاستيراد" وانقر فوق "متابعة".
   2. انقر فوق "تحديد الكل" وحدد "Baseline_1" للتكامل.
   3. لتحديد أول 10 ثوان من كل خط مسح (يتوافق مع وقت الإحماء بالليزر) ، قم بقص البيانات عن طريق إدخال القيم الثانية "0" و "(مدة السطر - 10 ثوان)" وانقر فوق "إضافة عمليات تكامل" ( على سبيل المثال ، لخط مسح 35 ثانية ، أدخل القيمتين "0" و "25").
5. لتحديد عينة البيانات، استخدم علامة التبويب "التحديدات التلقائية" كما هو موضح في 4.4، ولكن اختر "Output_1" كعملية تكامل. قم بقص البيانات من بداية ونهاية كل سطر قياسي لاستبعاد إشارة الخلفية ( على سبيل المثال لخط مسح 35 ثانية ، أدخل القيم "13" و "4").
6. لاستبعاد الانخفاض في الإشارة الناجم عن الثغرات المحتملة في المعايير ، في علامة التبويب "العينات" ، انقر فوق "القنوات" في الجزء العلوي الأيسر من منطقة الرسم البياني لتحديد قناة ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية ( على سبيل المثال ، C13 أو P31). قم بتدوين أي انخفاضات حادة في الإشارة وحدد قيمة CPS منخفضة بما يكفي لتكون أقل من التباين الطبيعي داخل العينات ، ولكنها عالية بما يكفي لالتقاط الانخفاض الحاد في الإشارة.
7. انقر فوق علامة التبويب "DRS" وحدد "Baseline_Subtract" ل "مخطط تقليل البيانات الحالي". اختر القناة من 4.6 ل "قناة الفهرس" وقيمة CPS ل "الحد المطلوب استخدامه عند إخفاء الإشارات المنخفضة". أدخل قيمة <0.5 ثانية ل "ثوان للقص قبل/بعد الإشارات المنخفضة" لحساب التأخير في نقل الإشارة من الليزر إلى ICP-MS.
8. لتأكيد الإخفاء الكافي لمناطق الإشارة المنخفضة، انقر مرة أخرى إلى علامة التبويب "العينات" وحدد تتبع قناة تمت معالجته ( على سبيل المثال.، Fe56_CPS). كرر وقم بتحسين قيم CPS و "Seconds لقص الإشارات المنخفضة قبل/بعد" كما هو الحال في 4.7 إذا لزم الأمر.
9. انقر فوق علامة التبويب "النتائج" واختر "تصدير البيانات" من القائمة المنسدلة للتطبيق الرئيسي. أدخل اسم ملف لإنشاء ملف بيانات جدول بيانات للنتائج ( على سبيل المثال، حسابات Std1، Std2...).
10. افتح ملف البيانات في برنامج جداول بيانات مناسب واحسب قيم CPS لكل قناة فردية ليتم تحديدها كميا. استخدم تركيزات المعادن المحددة مسبقا من رذاذ المحلول ICP-MS لحساب عامل التحويل من قيم CPS إلى جزء في المليون (μg g⁻¹) لكل عنصر قابل للقياس الكمي.
11. كرر الخطوات 4.3 - 4.10 لجميع مجموعات المعايير في التشغيل.

5. إنشاء الصور الكمية

1. اكتب "Biolite()" في موجه الأوامر لفتح البرنامج.
2. قم باستيراد بيانات العينة بالنقر فوق "تحميل الصور" وتحديد المجلد الذي يحتوي على ملفات .csv لنموذج الصورة.
3. تصحيح الخلفية
   1. انقر فوق علامة التبويب "خطوط الأساس" لتطبيق تصحيح الخلفية للعينة. في صورة الفوسفور (P31) المطلوبة على الشاشة ، حدد مناطق الخلفية باستخدام أداة رسم المستطيل. يؤدي اختيار أكبر عدد ممكن من المناطق إلى إنشاء خريطة على مستوى الصورة لانجراف الإشارة / البلازما لضمان التعويض الكافي من هذه العوامل المربكة.
   2. لجعل إشارة الخلفية أكثر وضوحا، حدد أداة تحرير الرسم البياني (أعلى يسار الصورة المعروضة) وانقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة. حدد "تعديل مظهر الصورة" وقم بتغيير "اللون الأول عند Z=" إلى قيمة سالبة كبيرة ( على سبيل المثال -100,000). تابع بالنقر فوق "تم".
4. انقر فوق علامة التبويب "المعايير" لإظهار جدول لعوامل تصحيح CPS / جزء في المليون. أدخل القيم المحسوبة من المعايير الواردة في الخطوة 4.10 لكل عنصر من العناصر. ستساعد هذه الخطوة في تصحيح انحراف الحساسية في ICP-MS. انقر فوق "انطلق!"
5. افتح "متصفح البيانات" من علامة التبويب "البيانات" ، والتي تحتوي على الصور لكل عنصر وكل خطوة.
6. لإنهاء صورة للتصدير ، حدد الصورة المطلوبة في مجلد "StdCorrImages" ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم الصورة (* _ppm) وانقر فوق "NewImage". انقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة لفتح "تعديل مظهر الصورة" لاختيار جدول الألوان ومقياس الألوان المطلوبين. أضف مقياس ألوان إلى الصورة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة وتحديد "إضافة تعليق توضيحي". حدد "مقياس الألوان" من القائمة المنسدلة العلوية اليسرى واستخدم علامات التبويب لتعديل مقياس الألوان المطلوب.
7. لتصدير صورة ، تأكد من تحديد الصورة المعنية وانتقل إلى علامة التبويب "ملف" وانقر فوق "حفظ الرسومات ...". حدد التنسيق المطلوب واحفظ الصورة. بدلا من ذلك ، يمكن نقل الصورة المحددة باستخدام أدوات النسخ واللصق.
8. كرر الخطوتين 5.6 و 5.7 لجميع الصور ذات الأهمية.
9. التحديد الكمي للمناطق المنفصلة
   1. لتنشيط أدوات عائد الاستثمار، انتقل إلى علامة التبويب "التحليل" و"الحزم" وحدد "معالجة الصور".
   2. حدد الصورة المطلوبة وانتقل إلى علامة التبويب "صورة" وانقر فوق "عائد استثمار ...". انقر فوق "بدء سحب عائد الاستثمار" واستخدم أداة رسم لتحديد منطقة الاهتمام في العينة. لإنهاء الرسم ، انقر فوق "إنهاء عائد الاستثمار".
   3. للحصول على إحصائيات عائد الاستثمار المحدد ، انتقل إلى علامة التبويب "صورة" وانقر فوق "إحصائيات ...".
   4. انسخ النتائج والصقها في جدول بيانات منفصل. كرر تحديد عائد الاستثمار (5.9.2) لجميع المناطق والعناصر ذات الاهتمام.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> شرائح قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المجهر الزجاجي الصوداn / an / aالشرائح النموذجية مناسبة لجميع التجاربNWR213 نظام الاستئصال بالليزرESI Ltdn / aالمستخدمة في هذه التجارب. الشركات المصنعة الأخرى مناسبة, قد تتطلب تعديلات على بروتوكولAgilent 8800 Series ICP-MSAgilent Technologiesغيرمستخدمة في هذه التجارب. الشركات المصنعة الأخرى مناسبة, قد تتطلب تعديلات على بروتوكولIoliteIolite Softwaren / aمتاح من http://iolite-software.com/. تتوفر طرق أخرى ، راجع بروتوكولExcelMicrosoftn / a IGOR ProWave Metricsn / aAvalable من https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm