تصوير التلألؤ البيولوجي لتقييم نمو الورم في شريحة دماغ الفأر العضوي

الملخص

المصدر: Ciraku, L., et. al. نموذج شريحة الدماغ خارج الجسم الحي لدراسة واستهداف نمو الورم النقيلي في الدماغ لسرطان الثدي. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تصوير الخلايا السرطانية التي تعبر عن لوسيفيراز في شريحة دماغ فأر عضوية. يضاف لوسيفيرين إلى الوسط ، ويتم وضع اللوحة داخل حجرة نظام التصوير في الجسم الحي. يتم ضبط معلمات التقاط الصور ، ويتم تحديد شكل الورم وحجمه. ثم يتم تسجيل الإشارات الحيوية المنبعثة من الخلايا السرطانية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

ملاحظة: تم استخدام إناث الفئران الرياضية Nu / Nu (6-8 أسابيع) في هذه الدراسة.

1. الحقن داخل الجمجمة للخلايا السرطانية

1. تعقيم جميع المعدات (ملاقط ، مقص ، مقص خياطة ، مثقاب يدوي) تحت دورة جافة من الأوتوكلاف لمدة تصل إلى 45 دقيقة في أكياس التعقيم ، بما في ذلك مؤشر التعقيم. إذا أجريت العمليات الجراحية على متعددة ، فقم بتعقيم الأدوات بين باستخدام معقم الخرز الساخن (حتى 3x).
2. قم بتخدير الفئران وفقا لبروتوكول العناية بالحيوان الخاص بالمستخدمين (على سبيل المثال ، الأيزوفلوران (4٪ للحث ، 1-2٪ صيانة) وإعطاء التسكين (تحت الجلد ، 0.1 مل من 0.1 مجم / كجم بوبرينورفين SR-LAB) قبل بدء الجراحة. تأكد من عمق التخدير الأمثل مع قرصة إصبع القدم.
3. ضع الفئران في إطار تجسيمي وقم بتثبيت الرأس باستخدام قضبان الأذن القياسية ( الشكل 1 أ ). ثم ضع مرهم العيون على العينين.
4. تعقيم سطح الرأس عن طريق الاستخدام المتكرر بالتناوب (3x) من مسحات اليود و 70٪ من الإيثانول قبل الشق.
5. استخدم مشرطا جراحيا لعمل شق خط الوسط بطول 1 سم عبر الجلد بزاوية قطرية قليلا على الخط الوهمي الذي يقسم دماغ الفأر إلى نصفين متماثلين لكشف الجمجمة. امسح أي دم بقطعة قطن.
6. قم بتحويل الجلد بشكل جانبي لفضح موقع الحقن: 2 مم على اليمين ، 1 مم للأمام بالإشارة إلى بريجما +2 متوسط الوحشي (+ 2 مل) ، +1 منضدة / ذيلية (+1RC).
7. استخدم لقمة البر (0.73 مم) لاختراق الجمجمة + 2 مل ، + 1RC إلى بريجما وحفر حفرة باستخدام ضغط طفيف وحركة التواء.
8. استخدم حقنة حقن الدماغ لحقن 5 ميكرولتر من 100,000 MDA-MB-231BR (يعبر بثبات عن البروتين الفلوري الأخضر أو GFP-Luciferase) في محلول ملحي عازل للفوسفات معقم 1x (PBS) عن طريق إدخال المحقنة في البداية بعمق 3.5 مم في الدماغ.
9. دع المحقنة تستقر لمدة 2 دقيقة. اسحبه لأعلى حوالي 1 مم ، وبعد دقيقتين ، قم بحقن النصف الأول من الحجم ببطء.
10. انتظر لمدة دقيقتين أخريين قبل حقن الباقي ، ثم اسحب المحقنة ببطء بعد 3 دقائق من الحقن النهائي. ملاحظة: الحقن البطيء تجريبي في السماح لامتصاص الحجم جيدا بواسطة أنسجة المخ وعدم إحداث تسرب بعد سحب المحقنة ، مما قد يؤدي إلى نمو الخلايا السرطانية خارج الموقع المقصود.
11. ضع شمع العظام على موقع الحقن على الجمجمة ثم استخدم خيوط البولي بروبلين لخياطة الأنسجة. سوف تتعافى الفئران في غضون 5 دقائق بعد إزالة التخدير.
12. راقب سلوكهم مباشرة بعد الجراحة لمدة 10 دقائق تقريبا ، وبعد 3 ساعات ، وفي اليوم التالي لتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى علاج خاص ، بما في ذلك حقن المحلول الملحي ، والطعام الطري ، وما إلى ذلك ، للمساعدة في الشفاء السريع.
13. مراقبة نمو الورم عن طريق التصوير الحيوي على نظام التصوير.
    1. لهذا ، أولا ، قم بتشغيل الأكسجين والأيزوفلوران في نظام التصوير. اسمح بتوزيع كليهما على غرفة منفصلة خارج صندوق التصوير.
    2. بعد ذلك ، قم بتشغيل البرنامج ، وتهيئة الأداة ، واختر الخيار المناسب لتصور جسم الماوس بالكامل والتقاطه.
14. ضع الفئران في غرفة منفصلة مع الأيزوفلوران وتأكد من عمق التخدير الأمثل مع قرصة إصبع القدم. حقن الفئران داخل الصفاق مع 200 ميكرولتر من 30 ملغم / مل لوسيفيرين.
15. انقل معدة الفئران إلى أنف غرفة التصوير المزود بالأكسجين والأيزوفلوران. قفل الغرفة ، واختر 2 دقيقة من التعرض لبدء التصوير.
16. استخدم أداة ROI (منطقة الاهتمام) الخاصة بالبرنامج لتحديد إشارة التلألؤ الحيوي للورم.
17. لتحليل حجم الورم، اختر أداة شكل الدائرة لتناسبها حول شكل الورم وحجمه. قم بقياس عائد الاستثمار والإبلاغ عن إجمالي القراءات.
18. اسمح بنمو الورم الصلب لمدة 12-14 يوما (أو حتى يصل لوسيفيراز إلى حوالي 7.0 × 10 ⁶ وحدات) ( الشكل 1 ب ) قبل توليد شرائح الدماغ. ملاحظة: زيادة عدد الخلايا المراد حقنها ستؤدي إلى نمو الورم بشكل أسرع. لذلك ، يمكن أن يحدث توليد شرائح الدماغ قبل 12 يوما. من ناحية أخرى ، سيؤدي الورم الأكبر إلى المزيد من شرائح GFP + إذا سمح له بالنمو لمدة 14 يوما. بعد 14 يوما ، تبدأ صحة الفئران في التدهور بسرعة. وبالتالي ، يجب زيادة مراقبة صحة إلى مرة واحدة يوميا بعد النقطة الزمنية البالغة 10 أيام ، ويجب استخدام أي فئران تظهر عليها علامات الألم و / أو الانزعاج لتوليد الشرائح.

2. قم بإنشاء شرائح دماغ

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات بعد عزل الدماغ في غطاء التدفق الصفحي المعقم. من الممكن عادة إنشاء 35-40 شريحة فردية تحتوي على خلايا سرطانية (إشارة لوسيفيراز) من فأر واحد محقون بخلايا MDA-MB-231BR ( الشكل 1C ).

1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف. ضع قطاعة الأنسجة في غطاء التدفق الرقائقي المعقم ونظف جميع الأدوات والأدوات بنسبة 70٪ من الإيثانول.
2. بعد 12-14 يوما من حقن خلايا MDA-MB-231BR داخل الجمجمة ، قم بتخدير الفئران وفقا لبروتوكول العناية بالحيوان الخاص بالمستخدم كما هو موضح في 1.2. تأكد من عمق التخدير الأمثل مع قرصة إصبع القدم.
3. قم بإزالة أدمغتهم ووضعها بسرعة (في غضون 45 ثانية) في السائل النخاعي الاصطناعي السكروز أو السكروز ACSF المكون مما يلي: 280 ملي مولار سكروز ، 5 ملي كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 2 ملي كلوريد المغنيسيوم (MgCl ₂ }) ، 1 ملي كلوريد الكالسيوم (CaCl ₂ ) ، 20 ملي مولار جلوكوز ، 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازيلين إيثان سلفونيك حمض أو هيبس ، 5 ملي مولار الصوديوم (Na +) -الأسكوربات ، 3 ملي ثيوريا ، 2 ملي مولار Na + ، 29 ملي بيروفات ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.3.
4. باستخدام مشرط حاد ومعقم أو شفرة حلاقة ، قم بقطع الأجزاء الزائدة من الدماغ التي لا تحتوي على أي ورم من جميع الجوانب ، بما في ذلك الجزء السفلي من الدماغ.
5. اجعل شكل الدماغ على مكعب غير مثالي ليجلس بشكل مسطح على ورق الترشيح المبلل ب ACSF على غطاء طبق مقاس 60 مم لتسهيل التقطيع. ملاحظة: تتم إزالة الأنسجة الزائدة من الدماغ حيث من غير المحتمل أن يكون الورم قد نما قبل التقطيع للسماح بتوليد شرائح GFP + في الغالب وإنشاء شكل للدماغ مستقر على سطح الأداة ولن ينزعج من الاهتزازات الناتجة عن التقطيع.
6. ضع عدة أوراق من دوائر ورق الترشيح المبللة مسبقا (مع ACSF) على منصة القطع وضع الأنسجة المسدودة فوقها.
7. اضبط حجم القطع على الأداة على 2 أو 2.5 وحدة على المسطرة المتوفرة لتقطيع الأنسجة إلى أقسام 200-250 ميكرومتر. ملاحظة: الشرائح التي يصل حجمها إلى 350 ميكرومتر أو رقيقة تصل إلى 100 ميكرومتر قابلة للتطبيق. بالنسبة للشرائح <200 ميكرومتر ، استخدم اهتزاز أو ضغط.
8. استخدم فرشاة الرسم (السمور) لنقل شرائح الدماغ إلى طبق يحتوي على السكروز ACSF وفصل الشرائح تحت مجهر ضوئي باستخدام إبر 27 جراما.
9. حدد الشرائح الموجبة ل GFP تحت المجهر الفلوري وانقلها إلى طبق جديد مقاس 60 مم يحتوي على 2-3 مل من وسائط شرائح البالغين (الوسط العصبي القاعدي A ، مكمل B12 2٪ ، مكمل N2 1٪ ، 1٪ جلوتامين ، 0.5٪ جلوكوز ، 10 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) باستخدام ماصة معقمة مقطوعة سعة 1 مل (فتحة واسعة). ملاحظة: يتم استبعاد شرائح الدماغ التي تحتوي على خلايا سرطانية تنمو على سطح الدماغ (ربما بسبب تسرب خلايا الحقن ، وما إلى ذلك).
10. انقل 3-5 شرائح إلى كل 30 مم ، 0.4 ميكرومتر بحجم المسام ، قم بإدراج ثقافة الأنسجة في ألواح من 6 آبار على مسافة لا تسمح بالنمو في بعضها البعض.
11. قم بإزالة الوسط الزائد من سطح الملحق باستخدام ماصة P1000 ، وأضف 1 مل من وسط شريحة الفأر البالغ أسفل كل ملحق وقم بموازنة الوسائط في الحاضنة قبل التقطيع.
12. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO ₂ ، و 95٪ رطوبة لمدة 24 ساعة قبل التصوير.

3. في الجسم الحي نظام التصوير (IVIS) تصوير الشرائح

ملاحظة: قم بإجراء خطوات إضافة لوسيفيراز ومثبط في غطاء التدفق الصفحي المعقم.

1. ماصة 5 ميكرولتر من محلول لوسيفيرين 30 مجم / مل في الوسط الموجود أسفل الإدخالات عن طريق رفع الملحق بالملقط ووضعها مرة أخرى في البئر بعد إضافة لوسيفيرين إلى الوسائط في البئر.
2. ضع اللوحة المكونة من 6 آبار مع الغطاء داخل غرفة التصوير الخاصة بالجهاز أسفل الكاميرا الثابتة وأغلق باب الغرفة.
3. افتح البرنامج وقم بتهيئة الجهاز.
4. اختر إعدادات الكاميرا التي تسمح بالتصور والالتقاط لبئر واحد فقط لكل صورة. حرك المسرح لأعلى (مجال الرؤية أو مجال الرؤية 5 سم) وضع البئر الذي يجب تصويره مباشرة أسفل الكاميرا.
5. اضبط وقت التصوير على الأنسب اعتمادا على شدة اللوسيفيراز الذي سينبعث منه الورم ، والذي يمكن أن يختلف من 10 ثوان إلى 5 دقائق. ابدأ بضبطه على 10 ثوان ثم قم بزيادته إذا كانت الإشارة منخفضة ولكن احتفظ بها متسقة لجميع النقاط الزمنية والظروف حتى نهاية التجربة ( الشكل 1D ).
6. استخدم أداة عائد الاستثمار (أداة شكل الدائرة) ، وقم بتدوينه حول شكل الورم وحجمه ، وقم بقياس عائد الاستثمار ، والإبلاغ عن إجمالي القراءات لتحديد إشارة الإضاءة الحيوية لكل ورم على الشريحة.

النتائج

الشكل 1. الحقن داخل الجمجمة ، وتوليد شريحة الدماغ ، ونمو BCBM خارج الجسم الحي. (أ) التمثيل التخطيطي للفأر أثناء الحقن داخل الجمجمة تحت أداة تجسيمية. (ب) صور تمثيلية للكشف عن التلألؤ البيولوجي للأورام من فئران Nu / Nu التي يبلغ عمرها 4-6 أسا...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 مل حقنة ، طرف الانزلاقBD309659 30 G1 / 2 إبرBD305106 6 آبارGenessee25-105 المجهر الآلي وبرنامج LUMAVIEWEtalumaLS720 B27 (GEM21) Gemini Bio-Products400-160 دورق 50 ملفيشر10-210-685 فرشاة رسم السمور الحادة ، مقاس # 5/0علوم المجهر الإلكتروني66100-50 حقنة حقن الدماغ شمع العظامModoMedDYNJBW25 شركة هاميلتون80430 CaCl₂Fisher ScientificBP510-250 D-Luciferin ملح البوتاسيومPerkin Elmer122799 شفرة حلاقة مزدوجةالحواف VWR55411-060 (95-0043) ورق ترشيح (# 2) دوائر كمية 4.25 سمفيشر09-805a (1001-042) فرشاة رسم السمور الناعم # 2/0علوم المجهر الإلكتروني66100-20 ملقطأدوات العلومالدقيقة 11251-20 الجلوكوزسيجما ألدريتشG8270 الجلوتامين (200 ملم)مجموعة الثقب اليدوي Corning cellgrow25-005-Cl مع لقم الثقب الصغير الصغيرأمازونYCQ2851920086082DJHEPES ، حمض مجانيفيشر ScientificBP299-1 فقط للفئران الإطار التجسيميجهاز هارفارد (هوليستون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية).72-6049 ، 72-6044 KClFisher ScientificS271-10 مقص جراحي كبيرأدوات العلوم الدقيقة14001-18 خلايا MDA-MB-231BRيرجى تقديم الدكتورة باتريشيا ستيجالمرجع 14 MgCl₂·6H₂O جهاز تصوير الفئران Fisher ScientificM33-500 برنامج تصوير الفئران Perkin ElmerIVIS 200 نظام Caliper Life Sciences (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية).برنامج الصور الحية قارئ الصفائح الدقيقةTecan Spark Mounting SolutionInvitrogenP36935 MTS كاشفPromega CellTiter 96 محلول مائي واحد (Cat: G3582) ملحق N2LifeTechnologies 17502-048 Neurobasal mediumLife تقنيات21103049 الفئران الرياضية Nu / Nuتشارلز ريفرز Labs (ويلمنجتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ParaformaldehydeAffymetrix19943 Pen / StrepLife Technologies145140-122 بولي بروبلين خياطةMedex توريدETH-8556H Povidone Iodine Swab العصيDME Supply USACat: 689286X شفرة مشرط # 11 (عبوة من 100) أدوات العلومالدقيقة 10011-00 مقبض مشرط # 3أدوات العلوم الدقيقة10003-12 بيروفات الصوديومSigma AldrichS8636 ملعقة / مسبارأدوات العلوم الدقيقة10090-13 شفرات الحلاقة غير المطلية ذات الحواف المزدوجة SS (شركة ماكينة الحلاقة الأمريكية (95-0043))VWR55411-060 السكروزأمريسكو57-50-1 مشرط جراحيExelint InternationalD29702 مفرمة الأنسجةBrinkman (نوع McIlwain) إدراج ثقافة الأنسجةMilliporePICMORG50 أو PICM03050