تصوير الجيل التوافقي الثاني في نموذج الفئران لدراسة عيوب التوبولين

الملخص

المصدر: Piazza ، V. ، وآخرون ، بصريات غير خطية خالية من الملصقات لدراسة العيوب المعتمدة على التوبولين في المايلين المركزي. J. Vis. Exp. (2023)

يوضح هذا الفيديو إجراء تصوير تشوهات الأنابيب الدقيقة في شريحة أنسجة دماغ الفئران باستخدام مجهر إثارة ثنائي الفوتون. يستخدم إشارات الجيل التوافقي الثاني (SHG) للكشف عن عيوب التوبولين وتقليل إنتاج المايلين.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. انقله إلى المجهر

1. إذا كان المجهر في غرفة مختلفة ، فقم بإعداد صندوق معزول به عبوات جل دافئة لنقل أقسام الأنسجة مع الحفاظ على درجة الحرارة. سيحافظ الصندوق أيضا على دفء الأقسام حتى يتم تصويرها.
2. ضع العينة تحت المجهر ، وتأكد من وضعها بشكل صحيح تحت الهدف عن طريق المراقبة المباشرة من خلال العينين ذات الضوء المنقول.
   ملاحظة: الهدف هو محاذاة الهياكل المنبعثة المتوقعة مع اتجاه تذبذب الليزر لتعظيم إشارة الجيل التوافقي الثاني المنبعثة (وبالتالي المكتشفة).
3. قم بإزالة HBSS الزائد بحيث يغطي فيلم سائل رقيق العينة بأكملها. افحص الفيلم السائل بصريا كل بضع دقائق لتجنب التبخر المفرط وتجفيف العينة.
   ملاحظة: وفقا للشروط الموضحة ، يتم استخدام القسم لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة. يتسبب تجفيف العينة في تأثيرات مصطنعة جذرية (الشكل 1 أ ). إذا كانت هناك حاجة إلى أوقات تصوير أطول ، يوصى بالنقع الدوري للقسم في وسط دافئ وجديد بدلا من إضافة المزيد من HBSS. يوصى أيضا باستخدام غرف التروية والغراء أو الاغاروز منخفض الذوبان لتثبيت الأنسجة عند إجراء تجارب أطول.
4. قم بإعداد مرحلة المجهر للتصوير غير الممسوح ضوئيا ، والذي قد يشمل إغلاق جميع أبواب غرفة الحضانة المظلمة أو تغطية غرفة الحضانة بقماش أسود مطلي بالبولي يوريثين.

2. التصوير

1. حدد وضع التصوير "غير المفوض" على طول مسار الإرسال. بهذه الطريقة ، سيتم تحسين التقاط إشارة SH الضعيفة للتوبولين.
2. حدد هدف LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. اضبط طاقة ليزر بين 13 ميجاوات و 26 ميجاوات ، مع وقت سكون بكسل يبلغ 12.6 ميكرو ثانية. التقط صورا لا يزيد حجمها عن 512 بكسل × 512 بكسل ، بسرعة 5 ومتوسط 2 ، لمتوسط وقت اكتساب يبلغ حوالي 15 ثانية.
   ملاحظة: قد يؤدي استخدام قوى ليزر أعلى و / أو أوقات مكوث أطول إلى إتلاف العينة ( الشكل 1 ب ).
4. التقط الصور أولا باستخدام مرشح تمرير قصير 485 نانومتر (SP485) ، وفي الخطوة الثانية ، أضف مرشح ممر نطاق ترددي حاد 405 نانومتر (BP405 ؛ الشكل 2 ).
   ملاحظة: يمكن التقاط صور المجال الساطع الزائف من خلال نفس الكاشف باستخدام ضوء الليزر المتبقي لخط مرئي (يعمل ليزر 405 نانومتر أو 488 نانومتر بشكل أفضل).

النتائج

الشكل 1: أمثلة على القطع الأثرية. ( أ) قطعة أثرية بسبب تجفيف العينة. (B) قطعة أثرية بسبب التعرض المفرط. أشرطة المقياس: 30 ميكرومتر.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 405/10 nm BrightLine (R) مرشح ممر النطاق الترددي أحاديالنطاق SemrockFF01-405 / 10-25قطر 32 مم ، مع حلقة مبيتنايلون أسود ، نسيج مطلي بالبولي يوريثينThorlabsBK55 'x 9' (1.5 م × 2.7 م) × 0.005 بوصة (0.12 مم) سميكةالمجهر متحد البؤرZeissLSM710NLO AxioObserver Z1المجهر المقلوب ، الهدف المستخدم هو LCI Plan-Neofluar 25x / 0.8 NAHanks ′ محلول الملح المتوازن (HBSS) Gibco14025-076يمكن تحضيره من مساحيقوحدة NDD ، النوع CZeiss000000-1410-101للكشف عن الإشارة ، وتقليل فقد الضوء. إسكان مجموعة مرشح 000000-1935-163 مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات SP485(PBS) يمكن تحضير Gibco10010-031من مساحيق أو علامات تبويبليزر نابضمتماسكChameleon Vision II680-1080 نانومتر ليزر قابل للضبط