مقالة منهجية

التصوير متحد البؤر بفاصل زمني لديناميكيات التغصنات العصبية في استخلاصات شبكية الفأر

يونيو 17, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Ing-Esteves، S. & Lefebvre، J. L. تصوير الفاصل الزمني للتعجير العصبي باستخدام وضع العلامات المتناثرة على الفيروسات المرتبطة بالغدة لمجموعات خلايا الشبكية المستهدفة وراثيا. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتصور الديناميكيات المتغصنة في مستخلصات شبكية الفأر الحية. يحدد خطوات تثبيت شبكية العين تحت مجهر متحد البؤر ، وإجراء التصوير اللامع لتصور الخلايا العصبية الداخلية النجمية ، والتقاط صور ثلاثية الأبعاد بفاصل زمني لمراقبة التغيرات في مورفولوجيا amacrine المتغصنة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. التصوير متحد البؤر بفاصل زمني لمستحضرات شبكية العين الحية كاملة

  1. قم بتجميع غرفة حضانة التصوير الحي لمجهر متحد البؤر المستقيم ، كما هو موضح في الشكل 1 .
    ملاحظة: بالنسبة للأنظمة متحدة البؤر المقلوبة ، يتم وضع الحوامل المسطحة على جانب خلايا العقدة الشبكية (RGC) لأسفل مباشرة على زلة الغطاء السفلي الزجاجي لغرفة الحضانة. بمجرد أن تتلامس شبكية العين مع الغطاء ، لا يمكن تحريكها.
  2. املأ الغرفة بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المؤكسج (aCSF) وقم بتشغيل المضخة ووحدة التحكم في درجة الحرارة (درجة الحرارة 32-34 درجة مئوية ، معدل التدفق 1 مل / دقيقة). لا تسمح لدرجة الحرارة بالارتفاع فوق 34 درجة مئوية.
  3. لنقل حامل الشبكية المسطح إلى غرفة التروية ، أوقف المضخة وقم بإزالة aCSF الموجود في الغرفة. ضع قرص إستر السليلوز المختلط (MCE) مع حامل الشبكية المسطح في غرفة الحضانة (الفارغة).
  4. ضع وزن عينة على الحامل المسطح ؛ بلل الوزن مسبقا لكسر التوتر السطحي. أعد ملء الغرفة ب aCSF الدافئ ، وقم بتدوير aCSF عند ~ 1 مل / دقيقة.
  5. ضع قطعة الأنف مع هدف غمس الماء 25x (الفتحة العددية 0.95) في غرفة التصوير. شاشة للخلايا المصنفة ذات الأهمية باستخدام ضوء epifluorescent ( الشكل 1C ).
  6. اضبط مستوى صوت التصوير لالتقاط الميزات المتغصنة ذات الأهمية.
    ملاحظة: التقطت هذه الدراسة الشجرة الشجيرية الكاملة بمعدل 1024 × 1024 بكسل لكل إطار ، وخطوة z 1 ميكرومتر ، ومعدل إطارات قدره 2 دقيقة بين كل مكدس z. أحجام الصور النهائية هي ~100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر × 20 ميكرومتر.
  7. لضبط طاقة الليزر على الإعداد الأمثل ، استخدم جدول بحث يحدد كل من وحدات البكسل المشبعة وغير المشبعة. أثناء المسح الضوئي ، اضبط طاقة الليزر بحيث لا تكون وحدات البكسل مشبعة (أي بكثافة 255 أو أعلى). استمر في التصوير طالما كان ذلك مطلوبا أو حتى يكون هناك انخفاض كبير ويمكن اكتشافه في إشارة الفلورسنت وزيادة في الضوضاء (عادة 2-4 ساعات).
    ملاحظة: يوصى بتقليل طاقة الليزر حيث تعمل خوارزميات التلاف على النحو الأمثل عند توزيع وحدات البكسل على النطاق الديناميكي الكامل. يجب ألا تتجاوز شدة البكسل 254 ؛ كشفت التحليلات التجريبية للعصبيات أن قيم البكسل التي تقل عن 170 مثالية لتفكك. تفضل سرعات المسح الضوئي السريعة (400-600 هرتز) مع متوسط الخط (2-3) على عمليات المسح الفردية الأبطأ لنفس إجمالي وقت بقاء البكسل. غالبا ما يتم تبييض منطقة التصوير المطول ضوئيا ، لكن أقسام المصنع الأخرى تظل قابلة للحياة. يمكن تصوير مناطق متعددة في حامل مسطح ، كل منها لمدة 2-4 ساعات ، مع وقت حضانة إجمالي يبلغ 6 ساعات. جلسات التصوير التي تتجاوز 6 ساعات لم يتم اختبارها بشكل منهجي. يعد تدهور العصبات والفقاع من علامات على أن صلاحية الزرع الخارجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

الشكل 1: إعداد غرفة حضانة تصوير الخلايا الحية. (أ) جهاز حضانة التصوير المباشر الذي يظهر مكونات التسخين والمحلول والتصوير. يشتمل السخان المزدوج على منصة غرفة حضانة ساخنة (دائرة خلفية مع أقطاب كهربائية زرقاء) وسخان محلول مدمج. (B

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أوراق ترشيح غشاء إستر السليلوز المختلط (MCE) ، محبة للماء ، حجم المسام 0.45 ميكرومترMilliporeHABG01 300 ماصة نقل بولي إيثيلين يمكن التخلص منها VWR470225-034 Chamber أنابيب البولي إيثيلين ، PE-160 10'Warner Instruments64-0755 وحدة تحكم سخان ثنائية القناة ، موديل TC-344CWarner Instruments64-2401 HC FLUOTAR L 25x / 0.95 W VISIR غمس الهدفLeica15506374 كابل وحدة تحكم السخانWarner InstrumentsCC-28 غرفة حضانة حمام كبيرة مع دعم الشريحةWarner InstrumentsRC-27L MPII مضخة التمعجية الصغيرةهارفارد جهاز هارفارد70-2027 PM-6D منصة تسخين مغناطيسية (سخان غرفة الحضانة)قطع أنابيب رأس المضخة من Warner InstrumentsPM-6D للمضخة التمعجية الصغيرة MPIIجهاز هارفارد55-4148 مرساة عينة (قيثارات) يجب أن تكون مرساة العينة من Warner Instruments64-0260متوافقة مع غرفة الحضانةSloflo In-Line Solution HeaterWarner InstrumentsSF-28 ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيومSigma-AldrichC7902 Carbogen (5٪ CO₂ ، 95٪ O₂)قد يختلف مورد X02OX95C2003102 AirGasحسب المنطقةD- (+)- الجلوكوزسيجما-ألدريتشG7021 HEPES ، محلول حمض الهيدروكلوريك HB0264 الحيوي الأساسي الحر ، 1 N Sigma-Aldrich H9892 سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومSigma-AldrichM2670 شرائط اختبار الأس الهيدروجيني (6.0-7.7) VWRBDH35317.604 بوتاسيوم كلوريد (KCl) سيجما ألدريتشP9541 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) Bio BasicDB0483 فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةSigma-AldrichRDD007 ImageJالمعاهد الوطنية للصحة (NIH)مصدر مفتوح

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

amacrine

مقالات ذات صلة