تصوير وقياس التجديد المحوري في الخلايا العصبية العقدية الشبكية للفئران

الملخص

المصدر: Portela-Lomba, M., et. al. الزراعة المشتركة للخلايا العصبية العقدية الشبكية للفئران ذات التغليف الشمي Glia ، كنموذج في المختبر لتجديد الجذر المحوري للبالغين. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو تصوير وقياس التجديد المحوري في الخلايا العصبية العقدية الشبكية للفئران (RGNs) المزروعة بشكل مشترك مع الخلايا الدبقية الشمية البشرية الخالدة. RGNs ذات علامات مناعية ، مع سوما حمراء ومحاور خضراء. تم التقاط الصور باستخدام مجهر التألق ، وتم تحديد النسبة المئوية للخلايا العصبية ذات المحور العصبي ومؤشر التجديد المحوري باستخدام برنامج التصوير.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. ثقافة التغليف الشمي البشري الدبقية (ihOEG و Ts12 و Ts14)

ملاحظة: يتم هذا الإجراء في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة الحيوية لزراعة الأنسجة.

1. تحضير 50 مل ME10 OEG استزراع متوسط.
2. تحضير 5 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium أو DMEM/F12-Fetal Bovine Serum (FBS) ، في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
3. قم بتسخين كلتا الوسائطين عند 37 درجة مئوية في حمام مائي نظيف لمدة 15 دقيقة.
4. قم بإذابة قوارير خلايا Ts12 و Ts14 عند 37 درجة مئوية في حمام مائي نظيف.
5. قم بإعادة تعليق الخلايا وإضافتها إلى وسط استزراع DMEM/F12-FBS المحضر في الخطوة 2.
6. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم.
7. تطمح إلى طاف.
8. أضف 500 ميكرولتر من وسط ME10 وأعد تعليق الحبيبات.
9. قم بإعداد طبق ثقافة خلية p60 مع 3 مل من ME10 وأضف المعلق الخلوي بالتنقيط.
10. تحرك لتوزيع الخلايا بشكل موحد عبر اللوحة.
11. خلايا المزروعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
    ملاحظة: بعد الوصول إلى التقاء ، يجب إجراء ممر آخر على الأقل لتحسين الخلايا للزراعة المشتركة. هناك حاجة إلى التقاء 90٪ قبل زرعها على أغطية الزراعة المشتركة. يبلغ متوسط عدد الخلية المتقارب p-60 7 × 10⁵ ل Ts14 و 2.5 × 10⁶ لخطوط الخلايا Ts12. يجب تمرير خطوط الخلايا Ts12 و Ts14 كل 2-3 أيام.

2. تحضير ihOEG (Ts12 و Ts14) للفحص

ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة قبل 24 ساعة من تشريح الخلايا العصبية العقدية الشبكية (RGNs) والزراعة المشتركة.

1. عالج أغطية Ø مقاس 12 مم ب 10 ميكروغرام / مل بولي إل ليسين (PLL) لمدة 1 ساعة < / >ملاحظة: يمكن ترك الغطاء طوال الليل في محلول PLL.
2. اغسل الغطاء بمحلول ملحي عازل للفوسفات 1x (PBS) ثلاث مرات.
3. افصل خلايا Ts12 و Ts14 ihOEG من طبق زراعة الخلايا p60.
   1. أضف 4 مل من وسط ثقافة DMEM/F12-FBS إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يسخن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي نظيف.
   2. قم بإزالة الوسط من الألواح واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل من حمض PBS-ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
   3. أضف 1 مل من التربسين EDTA إلى خلايا OEG واحتضن لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   4. اجمع الخلايا باستخدام ماصة p1000 وانقلها إلى الوسط المعد في الخطوة 3.1.
   5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم.
   6. تطمح إلى طاف.
   7. أضف 1 مل من وسط ME10 وأعد تعليق الحبيبات.
   8. احسب رقم الخلية في مقياس كثافة الدم.
4. قم بزرع 80,000 Ts14 خلية أو 100,000 خلية Ts12 / بئر على الغطاء في ألواح 24 بئرا في 500 ميكرولتر من وسط ME10.
5. خلايا المزروعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.

3. تشريح أنسجة الشبكية

ملاحظة: يتم استخدام ذكور فئران الويستار البالغة من العمر شهرين كمصدر RGN. شبكية العين (فأر واحد) ل 20 بئرا من طبق خلوي مكون من 24 بئرا. الأوتوكلاف المواد الجراحية قبل الاستخدام. يتم شراء مجموعة تفكك غراء تجاريا (جدول المواد). اتبع تعليمات مقدم الخدمة لإعادة التشكيل. أعد تكوين حمض D و L-2-amino-5-phosphonovaleric (APV) في مخزون 5 ملي مولار وإعداد الحصص العليا.

1. في يوم الفحص ، قم بإعداد الوسائط التالية.
   1. قم بإعداد طبق ثقافة خلية p60 مع 5 مل من محلول الملح المتوازن البارد من إيرل أو EBSS (قارورة 1 من مجموعة تفكك غراء).
   2. قم بإعداد طبق زراعة الخلايا p60 مع قارورة معاد تكوينها 2 (غراء) من مجموعة تفكك غراء بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من APV. ثم أضف 250 ميكرولتر من القارورة المعاد تكوينها 3 (DNase بالإضافة إلى 5 ميكرولتر من APV).
   3. في أنبوب معقم ، امزج 2.7 مل من القارورة 1 مع 300 ميكرولتر من القارورة 4 (مثبط البروتياز الألبومين والبيض). أضف 150 ميكرولتر من القارورة 3 (DNase) بالإضافة إلى 30 ميكرولتر من APV.
   4. تحضير 20 مل من وسط Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. التضحية بفأر بالاختناق بثاني أكسيد الكربون₂.
3. قم بإزالة الرأس عن طريق قطع الرأس بالمقصلة ؛ ضعه في طبق بتري 100 مم ورش الرأس بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضعه في غطاء تدفق رقائقي.
4. قطع شعيرات الفئران بالمقص حتى لا تتداخل مع التلاعب بالعين.
5. أمسك العصب البصري بالملقط لسحب مقلة العين بما يكفي لتتمكن من عمل شق عبر العين بمشرط.
6. قم بإزالة العدسة والخلط الزجاجي واسحب شبكية العين (الأنسجة الشبيهة بالبرتقال) ، بينما تبقى الطبقات المتبقية من العين بالداخل (بما في ذلك الطبقة الظهارية الصباغية).
7. ضع شبكية العين في طبق زراعة الخلايا p60 المحضر في الخطوة 3.1.1.
8. انقل شبكية العين إلى طبق ثقافة الخلايا p60 المحضر في الخطوة 3.1.2 وقم بتقطيعه بالمشرط إلى قطع صغيرة بحجم تقريبي < 1 مم.
9. انقله إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل.
10. احتضان الأنسجة لمدة 30 دقيقة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، مع التحريك كل 10 دقائق.
11. قم بفصل كتل الخلايا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة باستور زجاجية.
12. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
13. تخلص من المادة الطافية ، ولتعطيل غراء ، أعد تعليق حبيبات الخلية في المحلول المحضر في الخطوة 3.1.3. (1.5 مل للعينين).
14. قم بتحويل معلق الخلية هذا بعناية إلى 5 مل من القارورة المعاد تكوينها 4.
15. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
16. أثناء الطرد المركزي ، قم بإزالة وسط ME-10 تماما من لوحة الخلية OEG المكونة من 24 بئرا (المعدة مسبقا في الخطوة 2) واستبدله ب 500 ميكرولتر من وسط NB-B27 لكل بئر.
17. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسط NB-B27.
18. لوحة 100 ميكرولتر من تعليق خلية الشبكية ، لكل بئر من لوحة m24 ، على طبقات أحادية الطبقات المعالجة ب PLL أو OEG.
19. حافظ على المزارع عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 96 ساعة في وسط NB-B27.

4. التلوين المناعي

1. بعد 96 ساعة ، قم بإصلاح الخلايا لمدة 10 دقائق عن طريق إضافة نفس الحجم من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 1x PBS إلى وسط الثقافة (600 ميكرولتر) (التركيز النهائي PFA 2٪).
2. قم بإزالة الوسائط و PFA من اللوحة المكونة من 24 بئر وأضف مرة أخرى 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 1x PBS. احتضن لمدة 10 دقائق.
3. تخلص من المثبت واغسله 3 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق.
4. كتلة مع 0.1٪ تريتون X-100/1٪ FBS في PBS (PBS-TS) لمدة 30-40 دقيقة.
5. قم بإعداد الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت PBS-TS على النحو التالي: SMI31 (ضد بروتينات MAP1B و NF-H) الجسم المضاد أحادي النسيلة (1: 500). 514 (يتعرف على بروتينات MAP2A و B) مصل أرنب متعدد النسيلة (1: 400).
6. أضف الأجسام المضادة الأولية إلى المزارع المشتركة واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
7. في اليوم التالي ، تخلص من الأجسام المضادة واغسل الغطاء باستخدام 1x PBS ، 3 مرات ، لمدة 5 دقائق.
8. قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت PBS-TS على النحو التالي: بالنسبة ل SMI-31 ، Alexa Fluor 488 المضاد للفأر (1: 500). ل 514 ، مضاد للأرانب Alexa-594 (1:500).
9. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية الفلورية المقابلة لمدة 1 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة أو RT في الظلام.
10. اغسل الغطاء باستخدام 1x PBS ، 3 مرات ، لمدة 5 دقائق ، في الظلام.
11. أخيرا ، قم بتركيب أغطية مع وسيط التثبيت (جدول المواد) واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: عند الضرورة ، يمكن إجراء تلطيخ نوى الفلورسنت باستخدام DAPI (4،6-diamidino-2-phenylindole). قبل التركيب ، احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في الظلام باستخدام DAPI (10 ميكروغرام / مل في 1x PBS). اغسل الأغطية 3 مرات باستخدام 1x PBS ، وأخيرا ، قم بتركيب الغطاء باستخدام وسيط التثبيت.

5. القياس الكمي للتجديد المحوري

ملاحظة: يتم تحديد العينات كميا تحت هدف 40x لمجهر التألق. يجب التقاط ما لا يقل عن 30 صورة في حقول عشوائية ، مع ما لا يقل عن 200 خلية عصبية ، ليتم قياسها كميا لكل علاج. يجب تكرار كل تجربة ثلاث مرات على الأقل.

1. تحديد النسبة المئوية للخلايا العصبية ذات المحور العصبي (SMI31 العصبية الإيجابية) بالنسبة إلى إجمالي عدد RGNs (تم تحديده باستخدام MAP2A / B 514 التلوين المناعي الإيجابي للجسم العصبي والتشعبات).
2. تحديد مؤشر التجديد المحوري أو متوسط الطول المحوري (ميكرومتر / خلية عصبية). تعرف هذه المعلمة بأنها مجموع الأطوال (بالميكرومتر) لجميع المحاور المحددة ، مقسوما على العدد الإجمالي للخلايا العصبية المحسوبة ، سواء قدمت محورا عصبيا أم لا. يتم تحديد الطول المحوري باستخدام المكون الإضافي NeuronJ لبرنامج الصور ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة الأمريكية).
3. احسب المتوسط والانحراف المعياري والدلالة الإحصائية باستخدام البرنامج المناسب.

المواد