تصوير الخلايا باستخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي

الملخص

المصدر: Daniele, F., et. al مجسات GFP الحساسة للأس الهيدروجيني والأس الهيدروجيني لتقييم ديناميكيات حويصلة الناقل العصبي في خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y: تصوير الخلايا وتحليل البيانات. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تصوير خلايا الورم الأرومي العصبي البشري باستخدام مجهر مضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) لتصور الحويصلات المشبكية الموسومة بالفلوروفور. يتم تركيز الخلايا أولا في وضع التألق. ثم يتم إجراء التعديلات لتحقيق الانعكاس الداخلي الكلي ، مما يؤدي إلى توليد موجات زائلة تثير الفلوروفورات بشكل انتقائي بالقرب من الغشاء. قبل تصوير TIRF ، يتم تكوين معلمات الاستحواذ ، ويتم ضبط تردد أخذ العينات.

البروتوكول

1. زراعة الخلايا والتعدي

1. SH-SY5Y زراعة الخلايا
   ملاحظة: تم إجراء التجارب باستخدام الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266). تنمو خلايا SH-SY5Y كمزيج من العناقيد العائمة والخلايا الملتصقة. اتبع التعليمات الواردة في البروتوكول (كثافة الخلية ، نسبة الانقسام ، إلخ) للحصول على خلايا تنمو مرتبطة بإحكام بالغطاء الزجاجي ، وهو أمر بالغ الأهمية للفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM).
   1. قبل البدء ، تحت خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي ، اصنع الحجم المناسب لمحلول ملحي عازلة الفوسفات المعقم (PBS) ووسط الاستزراع.
      1. اصنع 50 مل من PBS بت....

النتائج

الشكل 1. إعداد مجهر TIRF. عرض تخطيطي وصورة (داخلية) لنظام المجهر TIRF. يشتمل الإعداد على مجهر مقلوب آلي Axio Observer Z1 (A) ، وليزر أرجون أيون متعدد الخطوط بقدرة 100 ميجاوات (B) ، ومنزلق TIRF (C). يظهر ضوء الليزر (الخط الأخضر) والضوء الأبي.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Equipment
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	مقلوب microscopehttp://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
ليزر الأرجون متعدد الخطوط لاسوس 77	لاسوس	00000-1312-752	multi-line (458/488/514 nm) ، 100mW أرجون أيون laserhttp://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
ليزر TIRF المنزلق	Zeiss	423681-9901-000	http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100x الهدف	زايس	421190-9900-000	النفط ، NA 1.45 Alpha-Planhttps://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421190-9900-000&ss=1
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394	QImaging		http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
مبدل الفلتر البصري LAMBDA 10-3 مع	شركة	SmartShutter Sutter Instrument Company	http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
صورة البرمجيات
ProPlus 6.3 Software	Media Cybernetics		تحديد البقعة, اختيار عائد الاستثمار, كثافة التألق determinationhttp://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
Excel	Microsoft		تصحيح التبييض الضوئي ، الخلية الكاملة وحويصلة واحدة analyseshttp://office.microsoft.com/it-it/excel/
GraphPad Prism 4.00	GraphPad Software، Inc.		statistical analysishttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/