تصوير الخلايا باستخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي

Abstract

المصدر: Daniele, F., et. al مجسات GFP الحساسة للأس الهيدروجيني والأس الهيدروجيني لتقييم ديناميكيات حويصلة الناقل العصبي في خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y: تصوير الخلايا وتحليل البيانات. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تصوير خلايا الورم الأرومي العصبي البشري باستخدام مجهر مضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) لتصور الحويصلات المشبكية الموسومة بالفلوروفور. يتم تركيز الخلايا أولا في وضع التألق. ثم يتم إجراء التعديلات لتحقيق الانعكاس الداخلي الكلي ، مما يؤدي إلى توليد موجات زائلة تثير الفلوروفورات بشكل انتقائي بالقرب من الغشاء. قبل تصوير TIRF ، يتم تكوين معلمات الاستحواذ ، ويتم ضبط تردد أخذ العينات.

Protocol

1. زراعة الخلايا والتعدي

1. SH-SY5Y زراعة الخلايا
   ملاحظة: تم إجراء التجارب باستخدام الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266). تنمو خلايا SH-SY5Y كمزيج من العناقيد العائمة والخلايا الملتصقة. اتبع التعليمات الواردة في البروتوكول (كثافة الخلية ، نسبة الانقسام ، إلخ) للحصول على خلايا تنمو مرتبطة بإحكام بالغطاء الزجاجي ، وهو أمر بالغ الأهمية للفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM).
   1. قبل البدء ، تحت خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي ، اصنع الحجم المناسب لمحلول ملحي عازلة الفوسفات المعقم (PBS) ووسط الاستزراع.
      1. اصنع 50 مل من PBS بتركيزات 150 ملي كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 24 ملي مولار من الفوسفات ، الرقم الهيدروجيني 7.4. تصفية الحل.
      2. اصنع 50 مل من وسط الخلية من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع نسبة عالية من الجلوكوز ، ومصل الأبقار الجنينية المعطل للحرارة بنسبة 10٪ (FBS) ، والبنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، و L-glutamine (2 مل) ، وبيروفات الصوديوم (1 مل). تصفية الحل.
   2. قم بإزالة وسط النمو الكامل واغسل الخلايا ب 3 مل من PBS.
   3. احتضان الخلايا ب 2 مل من 0.05٪ حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (لطبق بتري 6 سم) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO _{2 ،} وافصل الخلايا باستخدام ماصة.
   4. قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة 2 مل من DMEM وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
   5. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 1 مل من DMEM إلى الحبيبات ، وقم بتقطيع المحلول لأعلى ولأسفل بما يكفي لتفريق الخلايا في معلق أحادي الخلية.
   6. قسمهم 1: 4 في طبق بتري جديد بقطر 6 سم يحتوي على 3 مل من الوسط الكامل. الحفاظ على الخلايا في المزرعة في أطباق بتري بقطر 6 سم عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪₂. الاستزراع الفرعي مرة واحدة في الأسبوع ، أو عندما يغطي 80-90٪ من مساحة السطح.
2. طلاء الخلايا SH-SY5Y للتصوير
   1. بالنسبة لتجارب TIRFM ، يتم وضع خلايا الصفائح على أغطية زجاجية. استخدم أغطية زجاجية بسماكة 0.17 ± 0.005 مم ومعامل انكسار 1.5255 ± 0.00015. قبل البدء ، قم بإعداد الغطاء الزجاجي على النحو التالي:
      1. أغطية زجاجية نظيفة بنسبة 90٪ من الإيثانول طوال الليل (O / N).
      2. اشطفها جيدا بالماء المقطر (ثلاثة تغييرات في الماء المقطر). أغطية زجاجية جافة في فرن التجفيف.
      3. ضع الأغطية في أطباق بتري الزجاجية وتعقيمها في فرن محمى على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
   2. في اليوم السابق للتعداء ، ضع كل غطاء في طبق بتري 3.5 سم ، وأضف 1 مل من وسط الاستزراع ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪₂.
   3. قم بعمل التربسين للخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.1.3 - 1.1.5 ، وقم بتعليق حبيبات الخلية في 1 مل من الوسط الكامل ، ثم قم بالعد. احسب الحجم الصحيح لتعليق الخلية لإضافته إلى كل طبق بتري لإنتاج 3 × 10 ⁵ خلايا / بئر. هذه الكثافة مطلوبة للنمو الأمثل للخلايا والتعداء الفعال. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة أكسيد الكربون بنسبة 5٪ _{} 2} حاضنة O / N.
3. SH-SY5Ytransfection بواسطة polyethylenimine (PEI)
   ملاحظة: لتصور ديناميكيات الحويصلات المشبكية ، تم استخدام متجه pCB6 يحتوي على synapto-pHluorin. تم إنشاء synapto-pHluorin عن طريق الاندماج في الإطار لمتغير حساس للأس الهيدروجيني من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وبروتين الغشاء الحويصلي synaptobrevin 2. تم استخدام البناء على نطاق واسع للتحقيق في خصائص الحويصلة المشبكية داخل الخلايا العصبية.
   1. قبل البدء في التعداء ، اصنع 10 مل من المحاليل التالية. احتفظ بالحلول لمدة أقصاها 1 شهر.
      1. اصنع محلول كلوريد الصوديوم 150 ملم. اضبط على درجة الحموضة 5.5 مع حمض الهيدروكلوريك 0.01 نيوتن (HCl).
      2. اصنع محلول PEI بنسبة 10٪ بولي إيثيلينيمين (PEI ؛ 25 كيلو دالتون خطي) في محلول كلوريد الصوديوم 150 ملي. يرتفع الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 8.8. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 مع 0.01 نيوتن حمض الهيدروكلوريك
   2. بعد 24 ساعة من الطلاء ، قم بإزالة الوسط وقم بتحديثه ب 1.5 مل من الوسط الكامل. احتفظ بالخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂.
   3. تحت خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الرقائقي ، في أنبوب ميكروفيوج سعة 1.5 مل ، أضف 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي إلى 25 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 150 ملي مولار و 100 ميكرولتر من محلول PEI لكل طبق بتري 3.5 سم.
   4. دوامة لمدة 10 ثوان ، ثم احتضان خليط الحمض النووي / PEI لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   5. أضف خليط الحمض النووي / PEI بعناية إلى طبق بتري الذي يحتوي على أغطية مع الخلايا ورجه برفق لتوزيع الكاشف بالتساوي في طبق بتري.
   6. بعد 4 ساعات ، قم بتغيير الوسط واحتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO بنسبة 5٪ ₂ . إجراء تجارب التصوير بعد 24 - 48 ساعة من التعدي.

2. تصوير الخلايا بواسطة TIRFM

1. إعداد التصوير
   1. قم بإجراء تصوير TIRF باستخدام الإعداد الموضح في الشكل 1 . وهو يتألف من مجهر مقلوب آلي ( الشكل 1 ، الإدخال A ) ، مصدر الليزر ( الشكل 1 ، الإدخال B ) ، وشريط تمرير TIRF ( الشكل 1 ، الإدخال C ). الوصول إلى إضاءة TIRFM من خلال فتحة عدمية عالية (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) زيت 100X ، هدف الغمر.
   2. لإضاءة TIRFM ، استخدم ليزر أرجون أيون متعدد الخطوط (458/488/514 نانومتر) 100 ميجاوات. باستخدام ألياف أحادية الوضع ، أدخل ضوء الليزر المستقطب خطيا في مسار الشعاع عبر شريط تمرير TIRF. أدخل شريط تمرير TIRF في مستوى الحجاب الحاجز للمجال المضيء لمسار شعاع الضوء العاكس.
      1. للإضاءة واسعة المجال ، قم بتوصيل المجهر بمصباح زئبق تقليدي قصير القوس ضوء HBO الأبيض. يضمن المنشور المزدوج الذي يحافظ على الاستقطاب في شريط التمرير مزيجا متزامنا من إضاءة TIRF والضوء الأبيض.
   3. قم بتصفية ضوء الليزر باستخدام مرشح إثارة (عرض النطاق الترددي 488/10 نانومتر) مركب على عجلة مرشح ويتم إدخاله في مسار الليزر. استخدم غالقا عالي السرعة يتم التحكم فيه بواسطة البرامج للسماح بالتحكم السريع في إضاءة الليزر. لتحليل pHluorin ، قم بتركيب مرشح انبعاث ممر النطاق 525/50 نانومتر. التقط صورا رقمية (512 × 512 بكسل) على كاميرا CCD سريعة مبردة باستخدام برنامج Image ProPlus.
2. تحقيق إضاءة TIRF (الشكل 2)
   1. تشغيل الليزر والكمبيوتر والكاميرا وعجلة المرشح ووحدات التحكم في الغالق؛ ثم انتظر 20 دقيقة قبل بدء التجربة حيث يحتاج الليزر إلى الإحماء والاستقرار.
   2. قبل التصوير ، اجعل الحجم المناسب للحلول التالية.
      1. اصنع 50 مل من محلول كريبس (KRH) عند 125 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 1.2 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم (MgSO ₄ ) ، 1.2 ملي مولار فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH ₂ PO ₄ ) ، 25 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-حمض إيثان سلفونيك (HEPES) (مخزن إلى درجة الحموضة 7.4) ، 2 ملي كلوريد الكالسيوم (CaCl ₂ ) ، و 6 ملي مولار جلوكوز.
      2. اصنع 10 مل من محلول KCl-KRH (الرقم الهيدروجيني 7.4) عند 80 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي كلوريد الكنيسيوم ، 1.2 ملي مولار كلوريد الصوديوم ₄ ، 1.2 ملي كيهان ₂ PO₄ ، 25 ملي مولار HEPES (مخزن مؤقتا إلى درجة الحموضة 7.4) ، 2 ملي كالوريد ₂ ، و 6 ملي مولار جلوكوز.
   3. قم بإزالة الغطاء الزجاجي بالخلايا المنقولة وأدخله في غرفة التصوير المناسبة. قم بتجميع الغرفة وأضف 500 ميكرولتر من محلول KRH في وسط الزجاج.
   4. أضف الزيت فوق الهدف. ضع غرفة التصوير على مسرح المجهر وضع الهدف تحت الغطاء الزجاجي. ضع الغطاء الآمن فوق العينة.
   5. في وضع التألق ، ركز على الغطاء (السطح العلوي) واختر الخلايا المنقولة الموضوعة في مركز الغرفة. حدد الخلايا التي يمكن تسجيل إشارة الفلورسنت الخاصة بها بوضوح باستخدام وقت تعريض أقل من 80 مللي ثانية.
   6. تحت تحكم البرنامج، قم بالتبديل إلى إضاءة TIRF في الوضع المباشر.
   7. لتعيين تكوين TIRF، تحقق من موضع الحزمة التي تخرج من الهدف على غطاء العينة ( الشكل 2B). عندما يتم وضع الشعاع في وسط العدسة الشيئية ( الشكل 2 أ ، إلى اليسار ) ، تظهر بقعة في وسط غطاء عينة TIRF ( الشكل 2 ب ، يسار ) ، ويتم تصوير الخلية في وضع التألق السطحي (عدة مستويات تركيز ، مضان خلفية عالية. الشكل 2 ج ، على اليسار).
   8. للوصول إلى الزاوية الحرجة ، حرك البقعة المركزة في اتجاه Y (للأمام أو للخلف ؛ الشكل 2 ب ، في الوسط) باستخدام برغي ضبط الزاوية على شريط تمرير TIRF ( الشكل 1C ). عندما يتقارب الشعاع على مستوى العينة بزاوية أكبر من الزاوية الحرجة ( الشكل 2 أ ، يمين ) ، تختفي البقعة ، ويظهر خط مستقيم ورفيع ومركز في منتصف غطاء العينة ( الشكل 2 ب ، على اليمين ).
   9. لضبط زاوية TIRF ، استخدم عينة الخلية ( الشكل 2C ). شاهد صورة التألق في الفيديو. في هذه المرحلة ، لا تزال الصورة الشبيهة بالتألق مرئية. حرك المسمار برفق حتى يتم تحقيق حالة TIRF: مستوى بصري واحد فقط من الخلية في التركيز (أي غشاء البلازما الملامس مع الغطاء). ينتج عن هذا صورة مسطحة ذات تباين عال ( الشكل 2C ، يمين).
3. عينة تصوير
   1. اضبط تجربة اللقطات المتتابعة أحادية القناة. لتقليل التبييض الضوئي ، التقط الصورة باستخدام وقت تعريض ضوئي منخفض وكسب مرتفع. تتراوح أوقات التعرض المناسبة بين 40 - 80 مللي ثانية. الحصول على الصور بتردد أخذ العينات من 1 إلى 2 هرتز. يمكن تقدير حركية الحويصلة بشكل أفضل لأخذ العينات بتردد أعلى (10 هرتز). عادة ما يكون الوقت العادي للمراقبة دقيقتين.

Results

الشكل 1. إعداد مجهر TIRF. عرض تخطيطي وصورة (داخلية) لنظام المجهر TIRF. يشتمل الإعداد على مجهر مقلوب آلي Axio Observer Z1 (A) ، وليزر أرجون أيون متعدد الخطوط بقدرة 100 ميجاوات (B) ، ومنزلق TIRF (C). يظهر ضوء الليزر (الخط الأخضر) والضوء الأبي...

Materials