الحقن المجهري التجسيمي لناقل فيروسي للتلاعب الجيني في جرو الفأر المخطط

الملخص

المصدر: Chen، S.، et al.، Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in الخلايا العقدية لأدمغة الفئران حديثي الولادة. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو الحقن التجسيمي لناقل فيروسي يشفر Cre recombinase وبروتين التألق الأخضر أو GFP في مخطط جرو فأر معدل وراثيا لتحقيق التلاعب الجيني عن طريق استئصال كاسيت STOP المحاط ب loxP ، وتنشيط بروتين التألق الأحمر أو RFP كمراسل.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الحقن المجهري

1. : قم بإعداد جراحة معقمة عن طريق مسح الأداة التجسيمية جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول. اغمر الأداة الجراحية في 70٪ إيثانول لتعقيمها.
2. افرك رأس الجرو بنسبة 70٪ من الإيثانول. حدد موقع لامدا التاريخي على الجمجمة وقم بتمييز لامدا بقلم تحديد. صوب طرف الإبرة في لامدا ، واضبط الإحداثيات الأمامية الخلفية (AP) والإحداثيات الإنسية الجانبية (ML) على أنها صفر.
3. حرك ذراع الحقن إلى الموقع المستهدف وفقا لإحداثيات X و Y للموقع المستهدف. بالنسبة لمخطط يوم ما بعد الولادة (P) 2 من الجراء ، فإن الإحداثيات هي: AP ، +2.4 مم أمام لامدا. ML ، ±1.0 مم جانبي من خط الوسط ؛ الظهرية البطنية (DV) ، −1.7 مم من الجمجمة. حدد موضع الصبغة الخضراء السريعة في أنبوب PE10 بقلم.
4. قم بإسقاط إبرة الحقن 30G ببطء لاختراق الجلد والجمجمة ، ثم ارفع طرف الإبرة حتى يتوقف عند سطح الجمجمة. اضبط إحداثيات DV على الصفر.
5. قم بإسقاط إبرة الحقن 30G ببطء حتى تصل إلى إحداثيات DV للموقع المستهدف. انتظر لمدة 1 دقيقة للسماح للحمة باستئناف شكلها الطبيعي. ثم قم بتشغيل برنامج الحقن المجهري (100 نانولتر / دقيقة).
6. تأكد من أن علامة الصبغة الخضراء السريعة تتحرك في أنبوب البولي إيثيلين لضمان حقن سائل الفيروس في الدماغ.
7. انتظر لمدة دقيقة واحدة بعد إنهاء الحقن المجهري ، ثم قم بإحضار الإبرة ببطء وتدريجي إلى 1/2 ارتفاع عمق DV في غضون 30 ثانية. بعد 30 ثانية ، اسحب الإبرة ببطء من رأس الجرو.

2. التعافي بعد الجراحة من الجرو

1. قم بتسخين الجرو لمدة 20 دقيقة في حاضنة 33 درجة مئوية. تحقق من تعافي الجرو من تخدير انخفاض حرارة الجسم كل 5 دقائق حتى يستعيد الجرو وعيا كافيا للحفاظ على الاستلقاء القصي.
2. أعد الجرو إلى السد بعد تعافي الجرو تماما.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 30G PrecisionGlide NeedleBecton DickinsonREF 305106 Hamilton MICROLITER حقنةهاميلتون8030030G إبرة مناسبة لأنبوب PE10 ؛ تحتاج إبرة 26G إلى محول PE20أنابيب البولي إيثيلين PE20بكتون ديكنسون427406 أنابيب البولي إيثيلين PE10بيكتون ديكنسون427401 مضخة حقنة معدل التدفق الصغيرمضخة مضخة الدقة الأطولTJ-2A (وحدة التحكم) و L0107-2A (وحدة القيادة) حقنة 25GBecton DickinsonREF 302105 أخضر سريعSigma-AldrichF-72520.10٪ أدوات التجسيم القياسيةRWD علوم الحياة68037بدون استخدام 68030 محول الفئران / حديثي الولادةLSM 880 مجهر متحد البؤرZeissLSM 880 AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40بنسلفانيا ناكهات كورAV-9-PV1848القطعة # CS0987 ، 5.506x1013 (GC / مل) B6. CG-GT (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / Jمختبر جاكسون7914Ai14B6 (Cg) -Foxp2tm1.1Sfis / CfreJمختبر جاكسون26259Foxp2fl / fl