الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصور الأحداث الغريبة

الملخص

المصدر: Winkle, C. C., et al. استخدام المنهجيات المجمعة لتحديد دور توصيل غشاء البلازما أثناء تفرع المحور العصبي وتكوين الخلايا العصبية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو الفحص المجهري الكلي لمضان الانعكاس الداخلي (TIRF) لتصور الأحداث الخارجية في الخلايا العصبية القشرية. تتألق علامة البروتين الفلوري الأخضر الحساس للأس الهيدروجيني (GFP) عند اندماج الحويصلة ، مع إثارة TIRF الانتقائية التي تلتقط إفراز الخلايا الغشائية القريبة في التصوير بفاصل زمني.

البروتوكول

1. تصوير الأحداث الخارجية عبر الفحص المجهري لمضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF)

ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول معدات مجهرية متخصصة ، بما في ذلك غرفة بيئية للحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون (CO₂) ، ومجهر مضان الانعكاس الداخلي الكلي المقلوب (TIRF) المجهز بإضاءة فائقة الفلورية ، وهدف TIRF للتكبير العالي / الفتحة العددية العالية (NA) ، وXYZ آلي المرحلة ، وكاشف الجهاز المقترن بالشحن الحساس (CCD). يستخدم هذا البروتوكول مجهرا مقلوبا مؤتمتيا بالكامل مزودا بهدف NA TIRF 100x 1.49 ، وليزر الحالة الصلبة 491 نانومتر ، ومضاعف للإلكترون CCD (EM-CCD). يتم التحكم في جميع المعدات عن طريق برامج التصوير والتحكم بالليزر. قبل بدء بروتوكول التصوير ، قم بتشغيل الغرفة البيئية ، المسرح ، المصباح ، الكمبيوتر ، والكاميرا.

1. حدد الهدف داخل برنامج التصوير. بمجرد تحديد الهدف في مكانه ، اربط السخان الموضوعي حول ذوي الياقات الزجاجية.
2. تأكد من أن الهدف قد تم إنزاله بالكامل قبل تأمين حاضنة المرحلة في فتحة المرحلة. صب الماء المقطر بالتساوي في مداخل حاضنة المسرح لمنع الانسكابات.
3. قم بتشغيل نظام الحضانة. افتح الصمام إلى خزان ثاني أكسيد الكربون₂ وتأكد من أن الضغط مناسب للنظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اترك الغرفة بعض الوقت للوصول إلى 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 37 درجة مئوية. قبل إضافة طبق التصوير ، ضع طبقا فارغا في الحاضنة لتجنب تكثيف الماء على الهدف.
4. قم بتشغيل مصدر الليزر.
5. افتح حاضنة المسرح وأضف زيت الغمر إلى العدسة. ضع العينة في الحاضنة وقم بتثبيتها بأذرع الثبات أو وزن الطبق. ارفع الهدف حتى يتلامس الزيت مع قاع العينة. قم بالتبديل إلى إضاءة الضوء المنقولة وابحث عن المستوى البؤري العصبي من خلال العينين.
6. ابدأ تشغيل برنامج الليزر وقم بتوصيله ببرنامج التحكم بالليزر. اضبط الإضاءة على المجال العريض وحدد الهدف (يوصى باستخدام 100 × 1.49 NA TIRF). اضبط معامل الانكسار للعينة (الخلايا ~ 1.38). اضبط شدة الليزر عن طريق إلغاء تحديد "TTL" (منطق الترانزستور والترانزستور) لليزر 491 نانومتر. اضبط شريط التمرير على 100، ثم أخرجه إلى قيمة تتراوح بين 20٪ و40٪. أعد التحقق من "TTL".
7. ركز على العينة مرة أخرى في إضاءة الضوء المنقولة. انتقل إلى برنامج التصوير ، وحدد إضاءة ليزر 491 نانومتر ، وافتح الغالق. اضبط بدقة النقطة المحورية لليزر على السقف وقم بتوسيطها في مركز الحجاب الحاجز المغلق مع إزالة المكثف. ضع المكثف رأسا على عقب على المقعد البصري حتى لا تخدش العدسة.
8. استبدل المكثف ، وانتقل إلى برنامج TIRF ، واضبط عمق الاختراق (PD) على 110 نانومتر. بعد ذلك ، قم بالتبديل من الإضاءة واسعة النطاق إلى وضع إضاءة TIRF للتصوير.
9. ابحث عن بروتين الغشاء المرتبط بالحوصلة 2 (VAMP2) - الخلايا التي تعبر عن الفلوورين من خلال العينين باستخدام التألق الفائفلوري واسع المجال مع مصدر الضوء الفائفلورسنت.
   1. ضبط معلمات التصوير (وقت التعرض والكسب وطاقة الليزر) لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء والنطاق الديناميكي إلى أقصى حد باستخدام الحد الأدنى من وقت التعرض وشدة الليزر لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية (على سبيل المثال ، التعرض بين 50 - 100 مللي ثانية ، مع كسب 15 - 30 عند 30٪ كحد أقصى لطاقة الليزر).
   2. تعيين ضبط تلقائي للصورة مستمر لكل خلية. احصل على مجموعة صور بفاصل زمني مع الاستحواذ كل 0.5 ثانية لمدة 5 دقائق. بالنسبة للحالة المحفزة بالنيترين -1 ، أضف 500 نانوغرام / مل من النيترين -1 إلى طبق الخلايا في غطاء التدفق الصفحي وأعد الطبق إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة قبل التصوير.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 35mm glass bottom live cell imaging cell platesmatek Corporationp356-1.5-14-Cيجب أن تكون مغلفة ب 1 مجم / مل بولي دي ليسين وشطفها قبل خلايا الطلاءأوليمبوس IX81-ZDC2 المجهر المقلوبأوليمبوس أوليمبوس لامدا LS مصباح زينونشركة Sutter Instruments شركة المرحلة البيئية الحاضنة العلويةTokai Hit 100x 1.49 NA TIRF الهدفOlympus Andor iXon EM-CCDAndor Cell برنامج التحكم TIRFOlympus Software المستخدم للتحكم ليزر لتصوير TIRFفيجي (الصورة J) المعاهدالوطنية للصحة ImageJ الإصدار 1.49t الأرنب متعدد النسيلة مضاد للإنسان VAMP2إشارات الخلية11829 Poly-D-lysineSigmap-7886مذاب في ماء معقم عند 1 مجم / مل