$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تصوير الأحداث الخارجية عبر الفحص المجهري لمضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF)
ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول معدات مجهرية متخصصة ، بما في ذلك غرفة بيئية للحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون (CO2) ، ومجهر مضان الانعكاس الداخلي الكلي المقلوب (TIRF) المجهز بإضاءة فائقة الفلورية ، وهدف TIRF للتكبير العالي / الفتحة العددية العالية (NA) ، وXYZ آلي المرحلة ، وكاشف الجهاز المقترن بالشحن الحساس (CCD). يستخدم هذا البروتوكول مجهرا مقلوبا مؤتمتيا بالكامل مزودا بهدف NA TIRF 100x 1.49 ، وليزر الحالة الصلبة 491 نانومتر ، ومضاعف للإلكترون CCD (EM-CCD). يتم التحكم في جميع المعدات عن طريق برامج التصوير والتحكم بالليزر. قبل بدء بروتوكول التصوير ، قم بتشغيل الغرفة البيئية ، المسرح ، المصباح ، الكمبيوتر ، والكاميرا.
- حدد الهدف داخل برنامج التصوير. بمجرد تحديد الهدف في مكانه ، اربط السخان الموضوعي حول ذوي الياقات الزجاجية.
- تأكد من أن الهدف قد تم إنزاله بالكامل قبل تأمين حاضنة المرحلة في فتحة المرحلة. صب الماء المقطر بالتساوي في مداخل حاضنة المسرح لمنع الانسكابات.
- قم بتشغيل نظام الحضانة. افتح الصمام إلى خزان ثاني أكسيد الكربون2 وتأكد من أن الضغط مناسب للنظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اترك الغرفة بعض الوقت للوصول إلى 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 37 درجة مئوية. قبل إضافة طبق التصوير ، ضع طبقا فارغا في الحاضنة لتجنب تكثيف الماء على الهدف.
- قم بتشغيل مصدر الليزر.
- افتح حاضنة المسرح وأضف زيت الغمر إلى العدسة. ضع العينة في الحاضنة وقم بتثبيتها بأذرع الثبات أو وزن الطبق. ارفع الهدف حتى يتلامس الزيت مع قاع العينة. قم بالتبديل إلى إضاءة الضوء المنقولة وابحث عن المستوى البؤري العصبي من خلال العينين.
- ابدأ تشغيل برنامج الليزر وقم بتوصيله ببرنامج التحكم بالليزر. اضبط الإضاءة على المجال العريض وحدد الهدف (يوصى باستخدام 100 × 1.49 NA TIRF). اضبط معامل الانكسار للعينة (الخلايا ~ 1.38). اضبط شدة الليزر عن طريق إلغاء تحديد "TTL" (منطق الترانزستور والترانزستور) لليزر 491 نانومتر. اضبط شريط التمرير على 100، ثم أخرجه إلى قيمة تتراوح بين 20٪ و40٪. أعد التحقق من "TTL".
- ركز على العينة مرة أخرى في إضاءة الضوء المنقولة. انتقل إلى برنامج التصوير ، وحدد إضاءة ليزر 491 نانومتر ، وافتح الغالق. اضبط بدقة النقطة المحورية لليزر على السقف وقم بتوسيطها في مركز الحجاب الحاجز المغلق مع إزالة المكثف. ضع المكثف رأسا على عقب على المقعد البصري حتى لا تخدش العدسة.
- استبدل المكثف ، وانتقل إلى برنامج TIRF ، واضبط عمق الاختراق (PD) على 110 نانومتر. بعد ذلك ، قم بالتبديل من الإضاءة واسعة النطاق إلى وضع إضاءة TIRF للتصوير.
- ابحث عن بروتين الغشاء المرتبط بالحوصلة 2 (VAMP2) - الخلايا التي تعبر عن الفلوورين من خلال العينين باستخدام التألق الفائفلوري واسع المجال مع مصدر الضوء الفائفلورسنت.
- ضبط معلمات التصوير (وقت التعرض والكسب وطاقة الليزر) لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء والنطاق الديناميكي إلى أقصى حد باستخدام الحد الأدنى من وقت التعرض وشدة الليزر لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية (على سبيل المثال ، التعرض بين 50 - 100 مللي ثانية ، مع كسب 15 - 30 عند 30٪ كحد أقصى لطاقة الليزر).
- تعيين ضبط تلقائي للصورة مستمر لكل خلية. احصل على مجموعة صور بفاصل زمني مع الاستحواذ كل 0.5 ثانية لمدة 5 دقائق. بالنسبة للحالة المحفزة بالنيترين -1 ، أضف 500 نانوغرام / مل من النيترين -1 إلى طبق الخلايا في غطاء التدفق الصفحي وأعد الطبق إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة قبل التصوير.