تثبيط النشاط العصبي واكتشافه باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية في الفئران

الملخص

المصدر: Lai, J., et al. التسجيل الفيزيولوجي الكهربي المتزامن والحقن الدقيق للعوامل المثبطة في دماغ القوارض. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو تقنية قائمة على الحقن المجهري لتسجيل الخلايا العصبية المتزامنة وتثبيطها في القولون العلوي للفئران. يتضمن الإجراء الاستهداف التجسيمي ، وحفر الجمجمة ، وإدخال حقن ، والذي يوفر ناقلا عصبيا مثبطا أثناء تسجيل النشاط العصبي. يثير التحفيز الضوئي إمكانات العمل ، بينما يثبط الحقن المجهري للدواء استثارة الخلايا العصبية. مع انخفاض مستويات الناقل العصبي ، يعود النشاط العصبي إلى خط الأساس ، مما يتيح دراسة كل من التثبيط والتعافي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تجميع ماصة حقن التسجيل

1. اسحب شعيرات دموية زجاجية بطول 7 سم تقريبا (قطر خارجي 1 مم) باستخدام مجتذب ماصة.
2. كسر طرف الشعيرات الدموية وتحقق من الفتحة تحت المجهر الضوئي. تأكد من أن القطر الداخلي يتراوح بين 30 ميكرومتر إلى 40 ميكرومتر.
3. أدخل سلكا فضيا بطول 7 سم في الشعيرات الدموية الزجاجية مع بروز 1 سم تقريبا من الطرف غير المدبب للماصة الزجاجية.
4. ثني الخيط الزائد بشكل متعامد إلى الشعيرات الدموية الزجاجية.
5. ضع قطرة من مادة لاصقة بلاستيكية مرنة على عمود إبرة تحت الجلد 30 جراما.
6. أدخل إبرة تحت الجلد 30 جم في الماصة الزجاجية وفقا للمخططات المعروضة في الشكل 1.
7. أضف طبقة ثانية من الغراء لضمان الختم المناسب من الوصلة بين الماصة الزجاجية والإبرة تحت الجلد.
8. اترك الماصة حتى تجف مع توجيه الطرف لأعلى لمدة 12 ساعة تقريبا لضمان المعالجة المناسبة للغراء. تظهر النتيجة النهائية في الشكل 2.

ملاحظة: يتم إجراء هذا الإجراء في التجارب الحادة ولا يلزم تعقيم طرف الماصة.

2. تحضير

1. ضع الجرذ في صندوق التخدير.
2. تحفيز التخدير باستخدام 4٪ أيزوفلوران لمدة 5 إلى 10 دقائق.
3. ضع على طاولة تجسيمية مع وسادة تدفئة ومسبار المستقيم للحفاظ على درجة حرارة الجسم 37 درجة مئوية. استخدم مخروط الأنف للحفاظ على التخدير بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران. قم بتأمين رأس الجرذ باستخدام قضبان الأذن وحامل الأسنان.
4. ضع مرهم العين أو قطرات العين ، والتي تشمل قطرات الأتروبين 1٪ للمساعدة في توسيع حدقة العين. لمنع الجفاف ، ضع قطرات التشحيم كل 30 دقيقة تقريبا.
5. احلق الرأس ونظفه باستخدام 10٪ بوفيدون اليود.
6. للتخدير الموضعي ، قم بحقن 0.5 مل من الليدوكائين بنسبة 2٪ تحت فروة الرأس في 2-3 مواقع عن طريق رفع الجلد وإدخال طرف الإبرة.
7. تأكد من مستوى مناسب من التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم وملاحظة قلة الحركة. بالإضافة إلى ذلك ، راقب معدل ضربات القلب للتأكد من أنه ضمن القيم الطبيعية (300 إلى 400 نبضة / دقيقة).
8. شق فروة الرأس في خط مستقيم على طول الوسيط بشفرة مشرط # 10 لكشف كل من الغرز الإكليلية والسهمية.
9. اكشف عن نقطتي Lambda و Bregma عن طريق دفع الأنسجة التي تغطي الجمجمة جانبا بملعقة جراحية.
10. قم بتسوية الجمجمة بحيث تكون موضعي Bregma و Lambda على نفس المستوى.
11. لتعيين النقطة المرجعية ، استخدم جهازا مجسما مع أنبوب زجاجي مركب لضبطه فوق Bregma مباشرة. سيكون هذا هو "الصفر" لإحداثيات القياسات الأمامية الخلفية والإنسية الجانبية.
12. قم بتعيين نقطة الاهتمام عن طريق تحريك الحامل التجسيمي إلى الإحداثيات المطلوبة ، ولاحظ الإحداثيات التجسيمية ، وارسم مربعا حول المنطقة المستهدفة التي تحدد مكان إجراء حج القحف.
13. استخدم مثقابا جراحيا مع مثقاب معقم على طول المربع المحدد ببطء دون ضغط لإزالة مادة العظام ببطء. احرص على عدم الحفر لفترة طويلة في نفس المنطقة ، لأنها ستنتج حرارة وتسبب آفات في القشرة.
14. عندما يصبح العظم الذي يحدد حج القحف رقيقا بدرجة كافية ، قم بإزالة الجزء الجمجمي بعناية باستخدام ملاقط لكشف القشرة.
15. غالبا ما يروي القشرة المكشوفة بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي لمنع جفاف الأنسجة.
    ملاحظة: إزالة الأم الجافية غير ضرورية على الفئران لأن طرف الحقن قوي بما يكفي للاختراق.

3. تعبئة وتركيب نظام الحقن

1. املأ المحقنة الدقيقة 5-10 ميكرولتر عن طريق الشفط بالزيت المعدني.
2. املأ الإبرة تحت الجلد بالماصة الزجاجية الثابتة بمحلول 0.5٪ Chicago Sky Blue (CSB) و 300 ميكرومتر γ-aminobutyric acid (GABA) أو محلول 2٪ ليدوكائين مع 0.5٪ CSB. خفف جميع المحاليل بالمحلول الملحي.
   1. في حالة وجود مادة وفيرة، املأها باستخدام حقنة عادية واستخدم الأساليب الاحترازية المعتادة لتجنب تكون فقاعات الهواء.
   2. في حالة المواد الأكثر تكلفة ، استخدم الزيت المعدني لملء الحقن ويمكن بعد ذلك إدخال العامل الكيميائي عن طريق الشفط. نظرا لأن فرق الكثافة بين الزيوت المعدنية والماء مرتفع نسبيا ، فإن هذه المادة مرشحة جيدة لحقن المحاليل المائية.
      ملاحظة: يمكن إضافة صبغة لتأكيد الفصل بين سائلين.
3. لملء ماصة الحقن، املأ حقنة سعة 1 مل بالمحلول عن طريق الشفط ثم قم بحقن المحلول ببطء في ماصة الحقن.
4. انتبه جيدا للتسربات في المناطق الموضحة في الشكل 1 عن طريق مسح هذه المناطق نظيفة ومراقبة التسريبات عن طريق حقن المحلول ببطء بالمحقنة.
5. قم بإزالة حقنة 1 مل. عند القيام بذلك ، تأكد من الحفاظ على ضغط خفيف على المكبس حتى لا يزيل الفراغ المحلول من ماصة الحقن.
6. املأ المحقنة الدقيقة بالزيت المعدني عن طريق الشفط وقم بتوصيلها بإحكام بماصة الحقن المملوءة ، ثم امسح بعناية أي محلول زائد من الحقن المجمع بالشاش.
7. تحقق من عدم انسداد الطرف عن طريق حقن حجم صغير جدا ، وهو ما يكفي لرؤية قطرة صغيرة تتشكل عند طرف الماصة الزجاجية.
8. قم بتركيب الحقن على نظام المضخة الدقيقة وتأكد من إصلاحه جيدا.
9. ضع طرف الحقن بعناية عند الإحداثيات المستهدفة وقم بخفض الطرف إلى سطح القشرة.
10. قم بخفض الحقن ببطء باستخدام الجهاز التجسيمي إلى الهيكل المستهدف (القولون العلوي في هذه الحالة) باستخدام الإحداثيات التشريحية المناسبة.
11. قم بتغطية القشرة المكشوفة بأجار دافئ لمنع جفاف الأنسجة.

4. الحقن والتعطيل القابل للانعكاس:

1. اضبط مضخة الحقن المجهري على حقن 400 إلى 800 نيولتر عند 40 نيولتر / دقيقة واضغط على تشغيل لبدء الحقن. لاحظ أن معدل الارتفاع سيظهر انخفاضا أثناء الحقن.
   ملاحظة: في الإعداد التجريبي ، تعافى النشاط العصبي في غضون ساعة بعد نهاية تسليم GABA. يمكن استخدام أي جهاز ميكانيكي معاير للضغط على حقنة الحقن المجهري من أجل إجراء الحقن.
2. بعد الحصول على البيانات الفيزيولوجية الكهربية ، القتل الرحيم باستخدام طريقة معتمدة من قبل لجنة أخلاقيات المحلية.

النتائج

فئة الشكل = 'الصورة image_resized image-style-align-center' style='display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75٪;'>

الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتجميع injectrode. يتم توصيل حقنة صغيرة (A) بماصة حقن التسجيل، والتي تتكون من إبرة تحت الجلد 30 جم (B) ملتصقة بسلك فضي (C) داخل ماصة زجاجية (D). تسلط...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Injection pump (UltraMicroPump III)WPI#UMP3 وحدة التحكم في الحقن (وحدة تحكم Micro4)WPI#SYS-MICRO4 حقنة هاميلتونHamliton (80301) 701LT 10 ميكرولتر SYRالمحاقن بين 5 و 10 ميكرولتر تستخدمجل السيانوا أكريليت لاصقKrazy GlueKG86648Rشكل الجل أسهل في التطبيق على عمود الإبرة تحت الجلد 30Gالماصات الزجاجيةWPI#TW100F-4جدار رقيق ، OD 1 مم OD ، معرف 0.75 مم مع ماصات خيوط مستخدمة720 مجتذب ماصة إبرةKopf720 Silver wireA-M Systems، Inc.782500عارية 0.010 "