توصيل الجينات تحت الظهر في الحبل الشوكي للفأر لتقييم التعبير الجيني

الملخص

المصدر: Tadokoro, T., et al. توصيل ناقل الفيروس المرتبط بالغدة 9 (AAV9) في الفئران البالغة. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تقنية الحقن تحت الظهر لتوصيل الجينات إلى الحبل الشوكي في الفئران. يتضمن الإجراء تعريض الأم الجافية ، وثقب الأم ، وحقن فيروس مؤتلف مرتبط بالغدة (rAAV) يحمل جينا يعبر عن البروتين الفلوري في الفضاء تحت السطح. بعد الحقن والتعافي ، يسهل الفيروس التعبير الجيني في خلايا الحبل الشوكي ، مما يتيح دراسة التعبير الجيني المستهدف.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. التحضير العام للحيوان والجراحة

1. قبل البدء في العملية الجراحية ، قم بإذابة الفيروس (AAV9-UBI-GFP [UBI: UBIQUITIN PROMOTER ، GFP: Green Fluorescent Protein] ؛ 5 ميكرولتر من الحصص الصغيرة). قم بإعداد محلول ديكستران بنسبة 5٪ (10,000 ميجاوات) عن طريق خلط مسحوق ديكستران في الماء المقطر. امزج محلول الفيروس مع محلول ديكستران بنسبة 5٪ 1: 1 إلى تركيز ديكستران نهائي بنسبة 2.5٪.
   1. قم بتخزين محلول الفيروسات على الجليد (4 درجات مئوية).
2. استخدم الفئران البالغة C57BL / 6J (ذكر وإناث ، 20-30 جم). قم بتخدير الفئران باستخدام 5٪ إيزوفلوران (في O₂ ، 1 لتر / دقيقة) والحفاظ عليها عند 2-3٪ من الأيزوفلوران المستنشق (في O₂ ، 1 لتر / دقيقة) بواسطة مخروط الأنف أثناء الجراحة ، اعتمادا على معدل التنفس واستجابة قرصة المخلب.
3. احلق ظهر باستخدام مقص الحلاقة ونظف الجلد باستخدام 2٪ كلورهيكسيدين.
4. في دراسات التعافي المزمن ، اتبع تقنية معقمة صارمة.
5. إذا كان سيتم إجراء الحقن تحت الظهر القطني ، فقم بقص الجلد المغطى بفقرات Th8-L1 بمشرط وافصل العضلة المجاورة للفقرات عن الفقرات الشوكية Th10-12 باستخدام المقص.
   1. قم بتركيب في إطار تجسيمي قياسي باستخدام مشابك العمود الفقري للفأر.
   2. احلق جانبي الصفيحة في فقرات Th10-12 باستخدام مثقاب الأسنان (مثقاب الثقب: 0.9 مم ، السرعة: 20,000 دورة في الدقيقة) حتى تظهر الشقوق.
   3. قم بإزالة شظايا العظام المتشققة بالملقط وفضح السطح الظهري للحبل الشوكي القطني.
   4. اقطع الجافية حوالي 1 سم باستخدام إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ 30 جم وملقط.

2. فتح غشاء Pial وإدخال الإبرة Subpial لتوصيل AAV9

1. قم بتركيب الإبرة المخترقة 34G pia في ذراع Z لمناور XYZ باستخدام حامل شعري زجاجي (الشكل 1A و B).
   ملاحظة: لتصنيع الإبرة المخترقة للبيا ، يتم شحذ الطرف المشطوف الأصلي لإبرة 34G باستخدام شطبة شعرية زجاجية مع صفيحة كاشطة من الماس - خشنة (طرف 5.0 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر الأحجام) وزاوية الطحن من 15 - 20 درجة. ثم يتم ثني طرف الإبرة (بطول 1 مم ، يقاس من الحافة) برفق إلى حوالي 90 درجة (الشكل 1 ب ، الإدخال الأيسر).
2. باستخدام منظار تشريح جراحي ، تم ضبطه على تكبير 8-10X ، اخترق pia بإبرة اختراق pia بحوالي 1 مم (الشكل 1C) باستخدام X-arm.
   1. حافظ على زاوية الإبرة المخترقة على سطح الأنسجة عند 5-10 درجات.
3. بعد فتح pia ، قم بإزالة الإبرة المخترقة للبيا أفقيا من المساحة السفلية (الشكل 1D) باستخدام X-arm.
   NOTE: تذكر الموقع المخترق بواسطة معلم ، مثل الأوعية الدموية.
4. قم بتحميل إبرة حقن 36G غير حادة بفيروس AAV9-UBI-GFP باستخدام حقنة دقيقة سعة 50 ميكرولتر متصلة بإبرة الحقن بأنبوب PE-10 أو PE-20.
5. قم بتركيب الإبرة في الذراع Z لمناور XYZ ثان (الشكل 1A و B) باستخدام حامل شعري زجاجي (الشكل 1B ، الإدخال الأيمن).
   ملاحظة: لتصنيع إبرة الحقن AAV9 تحت الظهر ، يتم تلميع الطرف الحاد لإبرة 36 G باستخدام شطبة شعرية زجاجية مع صفيحة كاشطة ماسية - خشنة (أحجام أطراف من 5.0 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر) لإزالة الحواف الحادة. ثم يتم ثني طرف الإبرة (بطول 2-3 مم ، يقاس من الحافة) برفق إلى حوالي 90 درجة. يتم إدخال إبر الحقن المخترقة والفرعية في أنابيب من الفولاذ المقاوم للصدأ بطول 1-2 سم 20G (10 مم من نهاية الإبرة) ولصقها بالإيبوكسي. مطلوب استخدام أنابيب 20 جم (قطرها 0.91 مم) لتثبيت آمن بحامل الشعيرات الدموية الزجاجية.
6. من خلال التلاعب بأذرع X و Y و Z للمناور الثاني ، ضع طرف إبرة حقن AAV9 في الموقع المخترق بيا ثم ادفعها بحوالي 2-3 مم في الفضاء السفلي من خلال فتحة غشاء القروض السابقة باستخدام ذراع X (الشكل 1E و F).
   ملاحظة: 1) يتم إعداد AAV9-UBI-GFP وفقا للبروتوكولات التي تم الإبلاغ عنها مسبقا ، ويتم تعديل العيار النهائي إلى 1.2 × 10¹³ نسخة جينوم لكل مل (gc / mL). 2) ليست هناك حاجة لتمييز موقع فتحة اللوحة لأنه يمكن التعرف عليها بسهولة (الشكل 1 د).
7. حقن AAV9-UBI-GFP (1.5 أو 3 أو 5 ميكرولتر) في المساحة السفلية باستخدام حقنة دقيقة سعة 50 ميكرولتر (انظر الجدول 1 للمجموعات التجريبية).
8. قم بإزالة إبرة الحقن من المساحة السفلية بعد اكتمال حقن AAV9-UBI-GFP.
9. أغلق العضلات والجلد باستخدام خياطة 4.0 أحادية الشعيرات ومشابك جراحية.
   ملاحظة: ليست هناك حاجة لإغلاق الفقرة المفتوحة.
10. اسمح للحيوانات بالتعافي على وسادة التدفئة.
11. للسيطرة على الألم ، حقن بوبرينورفين 0.05 مجم / كجم / sc كل 12 ساعة لمدة 2-3 أيام بعد الجراحة.

الجدول 1: المجموعات التجريبية. تم إجراء جميع التجارب على الفئران البالغة C57BL / 6J.

<فئة الشكل = "الجدول" >) الشوكي < td colspan = '5'> * - ثنائي = حقنتان تحت السطح ، واحدة يتم تسليمها في اليمين والأخرى إلى المساحة السفلية اليسرى للجزء (الأجزاء) المحقونة.

المجموعات التجريبية	موقع / مستوى توصيل AAV9 (*)	حجم AAV9 inj ، معدل التسريب	وقت البقاء على قيد الحياة	تحليل الأنسجة
المجموعة أ (ن = 7)	C2 (ثنائي	5 ميكرولتر / 5 دقائق	14 يوما	الدماغ + الحبل
الشوكي المجموعة ب (ن = 12)	L1-L2 (ثنائي)	1.5 ميكرولتر أو 3 ميكرولتر ، 60 ثانية / ميكرولتر	14 يوما	الدماغ + الحبل
الشوكي المجموعة C (ن = 6)	C2 + L1-L2 (ثنائي في كل مستوى)	5 ميكرولتر / 5 دقائق	14 يوما	الحبل

النتائج

فئة الشكل = 'image image-style-align-center image_resized' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: الإعداد التجريبي لإجراء الحقن تحت الظهر في فأر بالغ. (أ) لإجراء حقن أسفل الظهر في العمود الفقري في الفئران البالغة ، يتم استخدام اثنين من معالجي XYZ منفصلين (الأول والثاني). (ب

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات C57BL / 6J MiceJackson Labs664 Lab Standard Stereotaxic للفئرانجهاز هارفارد72-9568 محول العمود الفقري للفأر جهاز هارفارد72-4811 XYZ مناورStoelting51604 مضخة التسريب اليدويةStoelting51218 34G مشطوفة Nanofill إبرةالعالم أدوات الدقة NF34BV-2 36G إبرة حادة NanofillWorld PrecisionInstruments NF-36BL-2 Fluriso ، IsofluraneMWI Veterinary Supply502017 محلول الكلورهيكسيدينMWI الإمداد البيطري501027 20G الفولاذ المقاوم للصدأ إبرةBecton-Dickinson305175 23G الفولاذ المقاوم للصدأ إبرةBecton-Dickinson305145 30G الفولاذ المقاوم للصدأ إبرةBecton-Dickinson305128 قضيب القطنMWI Veterinary Supply27426 زجاج شعيرات دموية مشطبةNarishige InternationalSM-25B منزلق مجهر SuperfrostLeica MicrosystemsM80 50μl MicrosyringeHamilton81242 BD Intramedic PE-20 TubingBecton ، Dickinson427406 BD Intramedic PE-10 TubingBecton ، Dickinson427401 4-0 خياطة أحادية الشعيراتVetOneV1D397 زجاج شعري مشطوفNarishigePipet مطحنة صغيرة EG-40 5 دقائق إيبوكسي (إيبوكسي واضح) Devcon14310 DexternPolysciences، Inc19411 AAV9-UBC-GFPUCSD مختبر نواقل الفيروس الأساسية