زرع نافذة الحبل الشوكي في الفأر للتصوير في الجسم الحي

الملخص

المصدر: Pietruczyk, E. A., et al. استئصال الصفيحة الفقرية وزرع نافذة الحبل الشوكي في الفأر. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو زرع نافذة الحبل الشوكي في فأر مخدر للتصوير في الجسم الحي. يعمل البروتوكول على تثبيت الحبل الشوكي المكشوف باستخدام غطاء زجاجي من البورسليكات ولوح خلفي مطبوع ثلاثي الأبعاد. تتيح هذه الطريقة الفحص المجهري ثنائي الفوتون عالي الدقة لدراسة ديناميكيات الحاجز الدموي الدماغي والتفاعلات العصبية الوعائية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. زرع غطاء

1. زجاجي: ضع برفق زجاج غطاء البورسليكات 3 مم على الحبل المكشوف.
2. تأكد من تبريد الاغاروز إلى 39 درجة مئوية. باستخدام ملعقة صغيرة ، ضع 2٪ من الاغاروز / aCSF (السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي) على حافة زجاج الغطاء واسمح للتأثير الشعري بسحبه تحت السطح.
   ملاحظة: عند درجات حرارة أقل من 39 درجة مئوية ، قد يبدأ الاغاروز في الهلام. إذا حدث هذا ، فأعد التسخين باستخدام حمام مائي أو ميكروويف. يفضل بعض المشغلين أولا وضع قطرة واحدة من الاغاروز ووضع زجاج الغطاء في الأعلى.
3. ضع لاصقا للأنسجة على العمليات المفصلية العظمية المكشوفة للفقرات المجاورة السليمة عند المستوى الصدري 11 العمود الفقري الفقري والمستوى الصدري 13 العمود الفقري الفقري. ضع لاصقا إضافيا للأنسجة في حلقة حول موقع استئصال الصفيحة الفقرية ، على الوتر المجاور والعملية المستعرضة.
   ملاحظة: لاصق الأنسجة مطلوب للالتصاق السليم بأسمنت الأسنان في الخطوات اللاحقة. تشكل العمليات المفصلية مقعدا طبيعيا يمكن أن تستقر عليه اللوح الخلفي بثبات (الشكل 1). سيشكل الالتصاق بالعمليات المفصلية أقوى نقاط التعلق.
4. امزج أسمنت الأسنان مع المسرع في صينية خلط البورسلين. استخدم ملعقة صغيرة لنقل الأسمنت السني إلى طبقة لاصقة الأنسجة. استخدم الأسمنت للأسنان للصق اللوح الخلفي بالمجال الجراحي المتمركز فوق النافذة. اترك 10 دقائق حتى يشفى الأسمنت السني.
   ملاحظة: يوفر الالتصاق القوي للصفيحة الخلفية بالعمليات المفصلية الأمامية والخلفية الاستقرار الهيكلي الأساسي للزرع.
5. استخدم أسمنت أسنان إضافي لملء القاعدة الداخلية للوحة الخلفية ، والجانب السفلي من اللوحة الخلفية: واجهة الأنسجة.
   ملاحظة: التطبيق الإضافي لأسمنت الأسنان يحسن الالتصاق ويقلل من خطر تسرب سائل الغمر الموضوعي المجهر (المحلول الملحي) من أسفل اللوح الخلفي.
6. تقدم حامل اللوح الخلفي المتشعب إلى الموضع المناسب فوق النافذة. قم بتثبيت اللوح الخلفي في حامل اللوح الخلفي بمسامير.
   ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول حامل لوحة خلفية مصنوع خصيصا (الشكل 2G-h).
7. ضع المحلول الملحي على اللوح الخلفي لاختبار التسرب. في حالة تسرب أي سائل ، جفف المنطقة واستخدم المزيد من الأسمنت للأسنان.

2. تحضير التصوير

1. انقل إلى المنصة الجراحية إلى الطاولة البصرية.
   ملاحظة: يمكن نقل منصتنا الجراحية وحامل اللوح الخلفي وحامل مخروط الأنف الأيزوفلوران بين محطات التصوير الجراحية ومحطات التصوير ثنائية الفوتون كوحدة واحدة أثناء تطبيق التخدير المستمر للأيزوفلوران (الشكل 2D ، H). يمكن تجميع وحدات مماثلة من شوكات تثبيت وعوارض وأعمدة أعمدة داعمة يمكن الحصول عليها من مصادر تجارية (على سبيل المثال ، ThorLabs). بالنسبة للفحص المجهري داخل الحيوية ، يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن 11 بوصة من الخلوص بين هدف المجهر والطاولة البصرية لاستيعاب ارتفاع المنصة الجراحية.
قم
2. بتثبيت المنصة الجراحية على الطاولة البصرية باستخدام عمود تثبيت من الفولاذ المقاوم للصدأ وشوكة تثبيت مضادة.
3. ضع محلول ملحي طازج في بئر اللوح الخلفي. قم بخفض عدسة الغمر في الماء في البئر.
4. استخدم الضوء المنقول أو الإشعاعي لتحديد مجال الاهتمام والتركيز. قم بالتبديل إلى وضع المسح بالليزر وقم بإجراء التصوير في الجسم الحي وفقا لمرشحات الإثارة بالليزر ثنائية الفوتون ، وثنائية اللون ، وممر النطاق المناسبة للفلوروفورات الموجودة في الأنسجة6.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image-style-align-center image_resized' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto؛ width: 75٪؛ '>

الشكل 1. تصوير تخطيطي للموضع التشريحي لنافذة الحبل الشوكي. أ) تصوير تخطيطي للمنظر المتفوق للجسم الفقري الصدري السفلي ، والعملية الشائكة ، وجزء الحبل الشوكي (sc). تصور الدائرة المنقطة مقعد العملية المفصلية ، وهي نقطة ...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 3D مطبوعة بيضاوية خلفيةمخصصة مجال تصوير استقرارمجهر تشريح جراحيLeicaM205 Cمزود ب Leica FusionOptics ، هدف Planapo 0.63x M-series ، ومرحلة الانزلاقكاميرا مجهركاميرا ملونة LeicaMC170HD لتصور المجال الجراحيمرحلة الانزلاقLeica10446301المرحلة الانزلاقية مصنوعة من لوحين معدنيين. لوحة القاعدة ثابتة. تنزلق اللوحة العلوية على واجهة مدهونة للسماح بالحركة الدورانية والخطية.المحطة الجراحية وشوكة التثبيتWhale Manufactoringمخصصلاستئصال الصفيحةالفقرية SomnoSuite وحدة توصيل الأيزوفلوران منخفضة التدفقKent ScientificSS-01إدارة التخدير الجراحي مع مبخر رقمي متكاملمن الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 1.5 بوصة بعد التركيبThorLabsP50 / Mلتركيب المحطة الجراحية على طاولة بصرية للتصوير ثنائي الفوتونشوكة لقط مضادة للتركيب مقاس 1.5 بوصة بعدThorLabsPF175لتثبيت تركيب المحطة الجراحية على طاولة بصرية للتصوير ثنائي الفوتونجهاز هارفارد المثالي72-6065ترقق العظام لاستئصال الصفيحة الفقرية حمام مائيفيشر ساينتفيك15-462-10 مسدس الاحترار الملحيFST18010-00الكي النزيف الطفيفوسادة التدفئةالمعياريةBF11222سخان سيليكون مقاس 1.9 بوصة × 4.5 بوصة مع خيوط تفلون مقاس 20 بوصة ، مسبار مستقيم مقترن بالحرارة 10 واط ، 5 فولتK من النوعPhysitempRET3قياس درجة حرارة جسم الماوسالفازلينSigma8009-03-08مسبار المستقيم التشحيموحدة تحكم حرارية منظمة التغذية المرتدةمخصصةNAتشمل البدائل المتاحة تجاريا سلسلة Physitemp TCATPVA Surgical العين SpearsBeaver-visitec international40400-8Absorbingblood Electric CleringWahl41590-0438Trimming MouseFur Blade ، # 11FST14002-14ملقط الأدوات الجراحية، # 5FST11254-20 ملقط الأدوات الجراحية، # 4FST14002-14أداة جراحيةملقط تيتاتنيوم مسننWPI555047FTأداة جراحيةمقص قزحية التيتانيومWPI555562Sأداة جراحيةلاصق الأنسجة Vetbond3M084-1469SBتحضير سطح الأنسجة لأكريليك الأسنانصينية خلط السيراميكجاك ريتشيسون420716خلط عامل أكريليك الأسنان مع مسرعأكريليك الأسنان OrthojetLang Dental1520BLK ، 1503BLKاللوح الخلفي المرتبط بشكل دائم بالأنسجةزجاج غطاء دائري صغير ، # 1 سمك ، 3 ممجهاز هارفارد64-0720نافذة بصريةNaClFisher Scientific7647-14-5ل aCSFKClFisher Scientific7447-40-7ل aCSFGlucoseفيشر العلمي50-99-7ل aCSFHEPESSigma7365-45-9ل aCSFMgCl₂ · 6H₂OFisher Scientific7791-18-6ل aCSFCaCl₂ · 2H₂OFisher Scientific < td style = 'text-align: center ;'>#################For aCSFCarprofenRimadylQM01AE91تسكين الألمالماء المضاد للجراثيمهنري شاين2587428مخفف للكاربروفينإيزوفلورانهنري شاين11695-6776-2محلولجرس التخدير المرضعباكستر0338-0117-04ترطيب للفأرAgarose High EEOSigmaA9793نقطة هلام 34-37 درجة مئويةمرهم تشحيم بصريAkwa Tears68788-0697منع تجفيف القرنيةMOM مجهر ثنائي الفوتون