مراقبة التعبير الجيني في الوقت الحقيقي في شرائح الدماغ عبر التصوير ثلاثي الأبعاد

الملخص

المصدر: Shimojo، H.، et al. تصوير التلألؤ البيولوجي في الوقت الحقيقي لديناميكيات إشارات الشق أثناء تكوين الخلايا العصبية في الفئران. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، يتم استخدام مزارع الشرائح القشرية من أجنة الفئران المعدلة وراثيا لمراقبة التعبير الجيني من خلال التصوير ثلاثي الأبعاد. تستخدم صور التلألؤ البيولوجي والتألق والمجال الساطع لتصور التعبير الجيني في الوقت الفعلي أثناء التمايز العصبي داخل الأنسجة الأصلية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. تصور تعبير مراسل لوسيفيراز في ثقافات الشرائح
   1. ابدأ نظام التصوير الحي للتلألؤ قبل بدء التشريح. استخدم الشروط التالية لمزارع الشرائح القشرية: 40٪ O₂ و 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية.
   2. ضع زيت الغمر على العدسة الموضوعية 40x. ضع طبق العينة على مرحلة المجهر. احصل على صورة اختبار الفلورسنت واضبط الموضع ومستوى التركيز على المنطقة ذات الاهتمام تحت إضاءة ضوء الإثارة.
   3. قم بتشغيل اكتساب الفاصل الزمني عن طريق عمليات الاستحواذ ثلاثية الأبعاد (اللمعان ، والتألق ، والمجال الساطع) لمدة 24 ساعة (الشكل 1F-H). للحصول على صورة التلألؤ ، استخدم إعدادات الكاميرا التالية: معدل نقل منخفض (50 كيلو هرتز) ، تجميع 2 × 2 / 4 × 4 ، وقت تعريض ضوئي 10 دقائق / 5 دقائق. للحصول على صورة التألق والمجال الساطع، استخدم الإعدادات التالية: معدل النقل المتوسط (1 ميجاهرتز) ، وتجميع 1x1 ، ووقت التعرض 100 مللي ثانية.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image_resized image-style-align-center' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto؛ width: 75٪؛ '>

الشكل 1: صنع الشرائح القشرية للدماغ الجنيني وتصور ديناميكيات بروتين Dll1 في مزارع الشرائح القشرية. (أ) التحقق من التعبير عن EGFP باستخدام المجهر المجسم الفلوري. يظهر السهم الأحمر منطقة القشرة التي تعبر عن EGFP (بروتين الفلورسنت الأخضر ...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Cold Water circulator (Chiller)Julaboنموذج: F12-EDكاميرا CCD مبردةAndor Technology: iKon-M 934نظام الحاضنةTOKAI HITالموديل: INU-ONICSالمجهر المقلوبأوليمبوسالموديل: IX81المجهر المقلوبأوليمبوسالموديل: IX83جهاز إضاءة LEDCoolLEDالموديل: pE1MetaMorphالأجهزة الجزيئيةالموديل: 40000وحدة تحكم الغاز المختلطةTokkenالموديل: TK-MIGM OLO2عدسة موضوعيةأوليمبوسالموديل: UPLFLN 40X O