تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. حقن عوامل إعادة البرمجة في
- إعداد الدماغ ، والتنسيب التجسيمي والحفرملاحظة: يركز هذا البروتوكول على استخدام Ascl1 و Lmx1a و Nurr1 (ALN) لإعادة برمجة الخلايا الدبقية NG2 (Neuron-Glial Antigen 2) في الخلايا العصبية الداخلية. في تجربتنا ، يمكن الحصول على الخلايا العصبية الداخلية ذات النمط الظاهري المماثل باستخدام مجموعات عوامل أخرى
- حرك ذراع M / L-D / V للإطار التجسيمي إلى مكانه (فوق) وقم بتثبيته.
ملاحظة: يسمح الإطار التجسيمي بتعديل المحقنة على طول المحقنة الأمامية / الخلفية (المحور A / P ، Y) ، الإنسي / الجانبي (M / L ، X المحور) ، والمحور الظهري / البطني (D / V ، المحور Z). - حرك المحقنة على طول المحور المختلف للإطار التجسيمي لإحضار طرف الشعيرات الدموية الزجاجية فوق بريجما مباشرة (نقطة التقاطع حيث تلتقي صفائح الجمجمة المختلفة).
- تأكد من أن الطرف الشعري مستقيم تماما في كل من طائرات A / P و M / L. في حالة وجود بريجما غامضة ، خذ متوسط الغرز الجانبية وخط الوسط.
- عندما يتم وضع طرف الشعيرات الدموية بشكل صحيح فوق البريجما ، أعد تعيين كل من قيم M / L و A / P إلى 0.0 على عداد الإحداثيات الرقمية.
- للتأكد من أن رأس في وضع مسطح تماما ، استخدم عداد الإحداثيات الرقمية لقياس قيمة إحداثيات D / V عندما يكون ذراع A / P عند +2.0 و -2.0 (M / L = 0.0) ، وكذلك عندما يكون ذراع M / L عند +2.0 و -2.0 (A / P = 0.0). اضبط ارتفاع قضيب الأسنان وقضبان الأذن وفقا لذلك.
- انقل المحقنة إلى الإحداثيات المطلوبة لحقن النواقل الفيروسية في المخطط (A / P = +1.0 ؛ م / لتر = -2.0 ، بالنسبة إلى بريجما).
- ارفع المحقنة قليلا ، ومن خلال النظر إلى موقع الحقن من خلال المجهر ، قم بحفر ثقب باستخدام مثقاب الأسنان عند إحداثيات الحقن. ابدأ في الحفر في الموقع ، واعمل بطريقة دائرية ولطيفة.
ملاحظة: لا تضع الكثير من الضغط الهبوطي ، حيث يجب أن تكون لقمة الحفر حادة بما يكفي لتمرير العظم دون قوة إضافية. تجنب الحفر الطويل والمستمر لأن ذلك يولد الحرارة. - في نهاية الحفر ، تأكد من بقاء الأم الجافية سليمة ومعرضة للحقن.
- إعداد إعداد الحقنة
- ضع قطعة من الشاش القطني فوق الشق المفتوح واغسل المحقنة بمحلول ملحي.
- بعد التنظيف ، خذ فقاعة هواء من 1-2 ميكرولتر ، متبوعة ب 1 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على النواقل الفيروسية ، وتجنب أي فقاعات غير مقصودة. تأكد من أنه يمكن بسهولة تصور المحلول الفيروسي أسفل فقاعة الهواء ، أثناء الحقن.
- الحقن الفيروسي
- قم بإزالة الشاش القطني من فوق موقع الشق ، وقم بخفض المحقنة باستخدام ذراع D / V للإطار التجسيمي. عندما يقترب سطح الجمجمة ، انظر بعناية من خلال المجهر وقم بقياس مستوى D / V لمادة الجافية - يجب أن تنتفخ قليلا تحت ضغط لطيف.
- أثناء لمس الأم الجافية بطرف الشعيرات الدموية ، اضبط إحداثيات D / V على 0.0.
- اخفض المحقنة ، وتقدم ببطء إلى العمق المطلوب (D / V = -2.7 ، بالنسبة إلى الأم الجافية). تأكد من أن المسار خال من شظايا العظام ، بحيث لا يلاحظ أي انحناء للإبرة / الشعيرات الدموية.
ملاحظة: تشير الإحداثيات المعروضة إلى حقن عوامل إعادة البرمجة في مخطط الفئران NG2-Cre. يمكن استخدام الإحداثيات المقابلة لمناطق الدماغ الأخرى. اختبر دائما إحداثيات الحقن أولا باستخدام صبغة (على سبيل المثال ، Trypan Blue) ، أو حقن الخرزة الملونة ، أو ناقل فيروسي مراسل قبل حقن عوامل إعادة البرمجة في دماغ سلالة فأر جديدة. في حالة حقن التربان الأزرق ، يجب التضحية بالحيوانات مباشرة بعد الجراحة ، وتشريح الدماغ. يمكن قطع الأدمغة الجديدة باستخدام ميكروتوم ، أثناء تجميدها ، وتحديد موقع الحقن عن طريق تصور موضع الصبغة في الدماغ. إذا كان اختبار الإحداثيات باستخدام الخرز الملون, فمن الممكن تحديد موقع الحقن على الأدمغة المنفعة والمقطوعة بعد أسبوع من الحقن. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام حقنة بناقل فيروسي يحمل جين مراسل ، وتحديد موقع الحقن في أدمغة مقطوعة منفوعة. - حقن 1 ميكرولتر من المحلول الفيروسي بمعدل 0.4 ميكرولتر / دقيقة. عندما يتم حقن الحجم بالكامل ، اسمح لفترة انتشار مدتها دقيقتان قبل سحب المحقنة.
- بعد الانتشار ، اسحب المحقنة ببطء حتى يخرج طرف الشعيرات الدموية تماما من الدماغ.
- ضع قطعة من الشاش القطني على الجرح واغسل المحقنة بمحلول ملحي.
- حرك ذراع M/L-D/V للإطار التجسيمي خارج منطقة العمل.
- إغلاق الجرح وإجراءات ما بعد الجراحة
قم - بخياطة الشق بعناية باستخدام خيط خياطة.
ملاحظة: يجب التخلص من جميع خيوط الخياطة المستخدمة في المحقونة في كوب / قارورة تحتوي على محلول منظف مضاد للفيروسات. يستخدم نفس المحلول لتنظيف جميع الأسطح المحيطة بمنطقة الجراحة التي كانت على اتصال بالمواد الجراحية. يتم غسل جميع الأدوات الجراحية جيدا وتعقيمها في نهاية كل يوم جراحي. - قم بإزالة من الإطار التجسيمي وضعه في محطة ما بعد الجراحة ، والتي تتضمن قفصا نظيفا وساخنا ، والوصول إلى الطعام والماء ، وحيث يبقى حتى الاستيقاظ التام. خلال هذه الفترة ، راقب عن كثب حتى يستعيد وعيه.
- لا تقم بإيواء التي يتم تشغيلها مع لم يتم تشغيلها حتى تتعافى الأولى تماما من الجراحة.
- الإشراف على التي يتم تشغيلها يوميا. اعتمادا على الغرز المستخدمة ، تأكد من إزالتها إذا لزم الأمر. تم إعطاء جميع Bupenorphinum (Temgesic عند 1 مل / كجم) تحت الجلد كرعاية ما بعد الجراحة.
ملاحظة: في حالة التشغيل باستخدام نفس المحقنة في يومين متتاليين ، اغسلها بالماء ، متبوعا بالإيثانول 70٪ والماء مرة أخرى. اترك المحقنة مملوءة بالماء طوال الليل للسماح بذوبان أي بقايا محتملة.