التوصيل الكهربائي ل GABA في بؤرة الصرع للفأر المخدر

الملخص

المصدر: Slezia, A. et al. التوصيل الكهربائي لحمض γ-أمينوبوتيريك (GABA) في تركيز الصرع يمنع النوبات في الفئران. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو التوصيل الكهربائي لحمض جاما أمينوبوتيريك (GABA) لتثبيط نشاط النوبات في الفأر المخدر. يحدد الخطوات المتبعة في زرع المسبار ، وتسجيل النشاط العصبي ، وتحريض النوبات ، وتسليم GABA المتحكم فيه عبر مضخة أيون الموائع الدقيقة لتقييم فعاليته العلاجية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الجراحة / حج القحف

1. قم بإصلاح رأس الفأر المخدر في إطار تجسيم. باستخدام إبرة 30 جم ، قم بحقن روبيفاكايين مسكن موضعي (5 ميكرولتر ، 7.5 مجم / مل ، انظر جدول المواد) تحت الجلد في موقع الشق المخطط له. اترك 5 دقائق حتى يصبح ساري المفعول.
2. اصنع خط وسط مستقيم في الجلد فوق الجمجمة بمشرط. اسحب الجلد برفق نحو الجانبين باستخدام ملقط ناعم وقم بتثبيته جانبا باستخدام مشابك بولدوج serrefine لترك الجمجمة مكشوفة لمزيد من العمل.
3. نظف جمجمة اللفافة بمشرط أو أي أداة مماثلة. في حالة حدوث نزيف سطحي ، قم بإزالة الدم بمسحات قطنية أو قطع صغيرة من المناديل الورقية.
4. خذ برغي أرضي مطلي بالبوليسترين (3،4-إيثيلين ديوكسي ثيوفين) (PEDOT: PSS) (الحجم: # 00 ، القطر: 0.047 بوصة ، الطول: 1/8 بوصة ، انظر جدول المواد) بسلك ملحوم وقم بتوصيله بموصل إلى مقدمة مكبر الصوت.
5. بلل الجمجمة في موقع الثقب المطلوب وحفر حفرة بسرعة عالية باستخدام مثقاب دائري ناعم (بقطر 0.4 مم) على الجمجمة فوق المخيخ حتى تظهر الجافية. ضع المسمار الأرضي في الفتحة وقم بلفه بمفك براغي دقيق حتى يصل إلى الجزء العلوي من المخيخ.
   ملاحظة: تم طلاء برغي الرأس بغمس بمحلول PEDOT: PSS يحتوي على 1٪ 3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GOPS) بالوزن متبوعا بالخبز عند 140 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. PEDOT: PSS عبارة عن بوليمر مترافق بسعة حجمية معروفة بأنها متوافقة حيويا. GOPS عبارة عن رابط متقاطع ممزوج ب PEDOT: PSS لزيادة الاستقرار في الوسائط المائية (الشكل 1).
6. بمساعدة الإطار التجسيمي ، قم بقياس الإحداثيات التجسيمية لمنطقة الدماغ المطلوبة. على سبيل المثال ، منطقة الاهتمام هي الحصين ، الأمامي الخلفي (AP) -1.8 مم والمتوسطة الجانبية (ML) 1.8 مم من نقطة بريجما بناء على أطلس الدماغ للفئران.
   ملاحظة: هذه إحداثيات لنصف الكرة الأيمن (الشكل 1).
7. قم بترقيق مساحة قطرها حوالي 1 إلى 2 مم من الجمجمة فوق المنطقة المستهدفة باستخدام مثقاب أسنان موثوق به (انظر جدول المواد) يتم ضبطه بسرعة عالية حتى يبقى غشاء عظمي رقيق ومصقول جيدا وشفاف.
8. بعد ذلك ، إذا كان سمك غشاء العظام رقيقا بدرجة كافية (<200 ميكرومتر) ، فقم بعمل ثقب صغير باستخدام ملقط رفيع وقم بإزالة الطبقة الرقيقة من العظام برفق. استخدم إبرة ذات رأس خطاف مخصصة لإزالة الجافية. قلل من حجم حج القحف وبضع الجفاف لمنع تطور الوذمات وتقليل النبضات القلبية و / أو التنفسية في الدماغ.
   ملاحظة: يجب ملء حج القحف بقطرة من المحلول الملحي لمنع الجفاف ثم إعادة تعبئته بانتظام أثناء التجربة (الشكل 1).

2. إدخال مسبار السيليكون متعدد القنوات

1. استخدم أذرع تجسيمية بزاوية نقطة وصول طفيفة (20 درجة) لمسبار السيليكون لترك مساحة واسعة لتحديد موضع الغرستين الأخريين والحصول على مواقع التسجيل والحقن للقطب الكهربائي والمضخة الأيونية والماصة الدقيقة في أقرب وقت ممكن.
   ملاحظة: تمت تغطية الأقطاب الكهربائية والمحاقن والمضخات الأيونية بقطرة من محلول صبغة DiI (1،1'-dioctadecyl-3،3،3 '، 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate [DiI]) ، للتصور اللاحق لآثار الزرع (0.5 مجم / مل DiI في ثنائي ميثيل سلفوكسيد).
2. ضع مسبار السيليكون على الذراع التجسيمي المتصل بحامل مغناطيسي وضعه بجوار الإطار التجسيمي. اضبط زاوية AP (20 درجة) ثم قم بتوصيل المسبار بالمسرح الأمامي والمسمار الأرضي.
3. قم بخفض مسبار السيليكون ببطء في الحصين بمساعدة الذراع التجسيمية الدقيقة الدقيقة أو المعالج الدقيق الآلي لتجنب الحركات الجانبية (الشكل 1 والشكل 2).
   1. ابدأ برنامج التسجيل وسجل - باستخدام المسرح الأمامي ومكبر الصوت المتصل والكمبيوتر - إشارات عصبية كهربائية أثناء تحريك مسبار السيليكون متعدد القنوات من أعلى القشرة حتى يتم الوصول إلى الموضع الظهري البطني المستهدف (-1,800 ميكرومتر من السطح القشري). سجل وشاهد إشارة جهد المجال المحلي (LFP) أثناء الاختراق على شاشة الكمبيوتر.
      NOTE: تحكم في نزول المسبار بحيث يتحرك ببطء وبشكل مستمر أثناء التسجيل ، للحصول على تحكم بصري أفضل في الاختراق والوصول إلى المنطقة المستهدفة.
   2. استخدم نشاط التموج في الطبقة الهرمية لتكوين الحصين في LFP المسجل كعلامة للمنطقة المستهدفة.
      ملاحظة: يظهر نشاط التموج على قناة أو قناتين متجاورتين لمسبار السيليكون متعدد القنوات (Si) بمسافة 100 ميكرومتر بين مواقع التسجيل (الشكل 3).
   3. سجل إشارات LFP من طبقات القشرة والحصين في وقت واحد من خلال برنامج مكبر الصوت متعدد القنوات (انظر جدول المواد) بمساعدة مجسات Si متعددة القنوات (الشكل 3).

3. إدخال مضخة أيون الموائع الدقيقة (μFIP)قم

1. بتوصيل الأنابيب (انظر جدول المواد) بمدخل μFIP واملأ المسبار بمحلول حمض جاما أمينوبوتيريك 0.05 M (GABA). قم بإزالة الأنابيب وأغلق المدخل بغلاف فيلم البارافين. قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية بوحدة قياس المصدر.
2. أدخل μFIP بمساعدة الذراع التجسيمية بزاوية متوسطة جانبية (MP) (20 درجة). يظل مسبار Si مدرجا أثناء العملية برمتها.
   ملاحظة: μFIP مرن للغاية وقد يستفيد من دعم فرشاة رسم صغيرة ونظيفة لإبقائها مستقيمة حتى تصل إلى سطح الدماغ. بعد هذه الخطوة ، يمكن خفض μFIP برفق بحركات محورية.
3. اخفض μFIP ببطء مع الحركات المحورية ولا تدعه ينحني أبدا أثناء المسار حتى يصل إلى الإحداثيات الظهرية البطينية (DV) (-1,200 ميكرومتر من السطح القشري).
   ملاحظة: حاول وضع الجهازين (μFIP ومسبار السيليكون) بالقرب من بعضهما البعض قدر الإمكان ، مع الأخذ في الاعتبار مسافة 300 ميكرومتر من المخرج من طرف μFIP.
   تنبيه: تجنب أي مشكلات ميكانيكية بين الأجهزة وموصلاتها أثناء الإدخال (الشكل 1 ب والشكل 2 ب).

4. تحضير أجهزة لتحريض النوبات

1. تغيير الإبرة المعدنية للحقنة (10 ميكرولتر) (انظر جدول المواد). قم بإزالة الجزء المعدني الذي يحمل الإبرة، ثم ضع الماصة الدقيقة وثبتها (القطر الخارجي [OD]: 1.2 مم، القطر الداخلي [ID]: 0.75 مم، قطر الطرف: 20-50 ميكرومتر مع ± 0.5 سم من تناقص الساق)، ثم استبدل عنصر تثبيت الإبرة.
2. ضع المحقنة والماصة الدقيقة البورسليكات المرفقة بزاوية 20 درجة للخلف الإنسي (LM) لحقن 4-أمينوبيريدين (4AP) (50 ملي مولار في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي [ACSF]).
   تنبيه: لا تستخدم الإبرة المعدنية للحقنة أو ماصة دقيقة ذات طرف أكبر من 50 ميكرومتر.
3. ارسم 500 nL-1 μL من 50 mM 4AP بمساعدة مضخة الحقن الدقيق الآلية.

5. إدخال الماصة الزجاجية المرفقة بحقنة لحقن 4AP

1. قم بخفض الماصة الدقيقة الزجاجية المرفقة بالمحقنة إلى موضع DV المستهدف (-1,500 ميكرومتر) ، ثم حقن 250 نانولتر من محلول 4AP (الشكل 1 والشكل 2). ابدأ التسجيل باستخدام برنامج التسجيل. شاهد الشاشة وانتظر ظهور أول ارتفاع بيني.
2. ابدأ تسليم GABA بواسطة μFIP على الفور مع ظهور أول ارتفاع بين الأصابع. قم بتسليم GABA عن طريق تطبيق 1 فولت بين المصدر والهدف لمدة 100 ثانية متبوعا بإيقاف تشغيل 1 ثانية لمدة 30 دورة. بمساعدة برنامج التسجيل ، سجل لمدة لا تقل عن 2 ساعة
   ملاحظة: تبلغ الكتلة الإجمالية ل GABA التي تم تسليمها حوالي 1 نانومول (الشكل 4).
3. في نهاية التجربة ، قم بإزالة المجسات التي تم إدخالها برفق والمسمار الأرضي ، وقم بإزالة من المعدات التجسيمية. تم القتل الرحيم للحيوانات باستخدام جرعة زائدة من المخدرات (i.p.100 مجم / كجم بنتوباربيتال). تم تأكيد الوفاة عن طريق توقف التنفس والدورة الدموية.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image_resized image-style-align-center' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto ؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: بضع القحف التحمل وتوطين الغرسات في دماغ الفأر. (أ) عرض تخطيطي للجراحة ، حج القحف ، وهدف الغرسات في دماغ الفأر. (ب) الإحداثيات والزوايا التجسيمية المستخدمة لزرع الأجهزة...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 4APSigma275875 مكبر للصوتNeuralynx ، مونتانا ، الولايات المتحدة الأمريكيةالرقمية Lynx 4SX مكبر للصوتKJE-1001 Atlas Stereotaxiqueألين أطلس978-0470054086 ماصة زجاجية من البورسيليكاسوترBF120-69-15 مصفوفة الدماغWPIRBMA-200C ماكينة تشذيب العظامFST16109-14 موصلINSTECHSC20 / 15 Coton tigeMonoprixEMD 6107OD غطاء زلةMenzel-Glass15747592 DiI StainThermo FisherD282 DMSOSigma11412-11 DrillFOREDOMK1070 ملقطFST11412-11 GABASigmaA2129 GOPSSigma440167-100M حقنة هاميلتونهاميلتون80330 توريد مكونات المسمارTX00-2FH وسادة تسخينجهاز هارفاردمضخة حقن 341446 WPIUMP3-3 KeithleyTektoronix216A الكيتامينرينودين5787419 حامل مغناطيسيNarishigeGJ-1 الفئرانتشارلز ريفر612 مناور حركيScientifica ، المملكة المتحدةIVM ثنائي الصوديوم الهيدروجين فوسفاتسيجما255793 أحادي الصوديوم ثنائي هيدروجين فوسفاتسيجما7558807 NeuroTrace DiIThermofisherN22880 منشفة ورقيةكيمبرلي كلارك7552000 PBسيجماP4417 بيدوت: PSSCLEVIOS 81076212 PFAAcros Organic30525-89-4 مسبار درجة حرارة المستقيمجهاز هارفارد521591 RopivacaineKABI1260216 SalineSigma7982 ScalpelF.S.TAUST R195806 SeringueBD Medical324826 يوصى باستخدام مشبك SerrefineFST18050-284مسبار السيليكونNeuroNexus ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةA2x16-10mm-50-500-177 أو A1x16-5mm-150-703 إطار StereotoxicStoelting51733U XylazineBayer4007221032311