الحقن الفيروسي التجسيمي لتحرير الجينات العصبية المستهدفة في دماغ الفأر

الملخص

المصدر: Fricano-Kugler, C. J., et al. تصميم وتعبئة وتسليم فيروسات CRISPR الرجعية عالية الارتفاع والعدسات عبر الحقن التجسيمي. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو الحقن الفيروسي التجسيمي لتحرير الجينات العصبية بدقة في دماغ الفأر. يضمن البروتوكول توصيل الفيروس بدقة إلى التلفيف المسنن ، مما يتيح وضع العلامات الفلورية والضربة القاضية الجينية بوساطة كريسبر لدراسة الدوائر العصبية ووظيفة الجينات وآليات المرض في الجسم الحي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الحقن التجسيمي

1. تأكد من أن التهوية إلى جناح الجراحة مفتوحة لضمان تدفق الهواء المناسب. جهز الفأر للجراحة عن طريق تخديره بنسبة 4٪ من الأيزوفلوران في غرفة الحث. بعد التخدير ، احلق الرأس لتحضير موقع الحقن.
   1. ضع الماوس في أداة التجسيم باستخدام ملاقط لتحريك اللسان لأسفل وإلى الجانب. أدخل قضيب العض في الفم حتى تسقط الأسنان في الفتحة ، ثم قم بتأمين قضبان الأذن. تأكد من أن جسم الماوس على وسادة التدفئة وأن الأنف موجود في مخروط الأنف. مباشرة 4٪ أيزوفلوران في مخروط الأنف. تأكد من التخدير عن طريق الضغط على القدم بالملاقط والتأكد من عدم وجود رد فعل مذهل.
   2. ضع دموع اصطناعية لتليين العينين. الانتهاء من تحضير موقع الحقن عن طريق مسح الرأس المحلوق بجولات متناوبة من بوفيدون اليود والليدوكائين.
2. باستخدام مشرط ، قم بقص شق صغير على طول منتصف فروة الرأس. جفف الجمجمة بمسحة وبيروكسيد الهيدروجين إذا لزم الأمر للمساعدة في تصور البريجما.
   1. باستخدام نطاق تشريح ، حدد موقع bregma على الجمجمة وضع طرف الحفر على bregma. صفر (أو تسجيل) الإحداثيات التجسيمية الرقمية على المستويات x و y و z.
   2. من أجل التأكد من أن الرأس مستوي على المحور المنقاري إلى المحور ذيلي y ، ضع لقمة الحفر على lambda وقم بتسوية الرأس بحيث يكون الإحداثي z متساويا تقريبا في كل من bregma و lambda.
   3. للتأكد من أن الرأس مستوي على المحور x ، ضع لقمة الحفر عند y = 1/2 لامدا. تأكد من أن إحداثيات z تساوي 1 مم على كل جانب (x = +/- 1 مم) من الخيط السهمي. اضبط الجمجمة إذا كان هناك اختلاف في إحداثيات z عند 1 مم إلى يسار ويمين لامدا.
3. ضع المثقاب فوق الإحداثيات المطلوبة. بالنسبة للتلفيف المسنن ، استخدم الإحداثيات y = -1.9 من bregma و x = +/- 1.1. قبل الحفر ، اخفض الأيزوفلوران إلى 2٪ ، ثم حفر الجمجمة ببطء وبعناية.
   1. بعد حفر جميع الثقوب، قم بلصق المحقنة المملوءة على الأداة التجسيمية. قم بتوسيط المحقنة بصريا فوق الفتحة وقم بتصفير إحداثيات z عند الجمجمة.
   2. اخفض المحقنة ببطء إلى أعمق عمق z. بالنسبة للتلفيف المسنن ، فإن أعماق z هي -2.5 و -2.4 و -2.3. ابدأ الحقن بمعدل 0.25 ميكرولتر / دقيقة باستخدام حاقون تجسيم.
      1. بعد اكتمال الحقن عند أدنى عمق Z، انتظر 1 دقيقة، ثم ارفعه إلى الإحداثيات التالية وابدأ الحقن مرة أخرى. استمر في هذا النمط حتى يتم حقن جميع إحداثيات الحقن z. انتظر دقيقتين قبل إزالة المحقنة بعد الحقن الأخير.
         ملاحظة: لم يتم ملاحظة أي آثار ضارة على الأنسجة عن طريق حقن ما يصل إلى 2 ميكرولتر من الفيروس لكل نصف كرة في دماغ الفأر.
   3. كرر الحقن للآبار الأخرى.
4. بعد الحقن ، قم بإزالة الماوس من أداة التجسيم وخياطة فروة الرأس ب 6-0 خيوط حريرية. ضع الليدوكائين وكريم مضاد للبكتيريا على الجرح.
   1. حقن 0.8-1.0 مل من المحلول الملحي + كيتوبروفين (3-5 ملغ/كجم) عبر الطريق داخل الصفاق (IP) للتحكم في الألم. ثم ضع الماوس في غرفة الاسترداد الساخنة. لا تترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا تعيد إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td colspan = '2'> كواشف الجراحة التجسيمية الحقنة البيطرية استخدام الطبيب البيطري للحقنة TB حقنة فقط 1cc luer slip TB 100 / bxMed-Vet International1CCVLS Isoflurane  شفرات مشرط من الفولاذ المقاوم للصدأ ، # 10 ، 100 قطعة من Med-Vet InternationalJOR580S مرهم دموع اصطناعيMed-Vet InternationalRXPARALUBE-O PVP PrepSolutionMed-Vet InternationalHPIV108208H Normal SalineMed-Vet InternationalDYND500MLSH قضيب القطن ذو الرؤوسMed-Vet InternationalCTA6 مرهم مضاد حيوي ثلاثيMed-Vet InternationalRXTRIP-OI15 MONOJECT® Needles Soft 25 جم × 5/8 بوصة Med-Vet International25058 6-0 خيوط حريريةMed-Vet InternationalMV-711