تصور الشبكات العصبية والأوعية الدموية في جنين الدجاج

الملخص

المصدر: Delalande، J.، et.al. وضع العلامات المزدوجة لخلايا القمة العصبية والأوعية الدموية داخل أجنة الدجاج باستخدام تطعيم الأنبوب العصبي GFP للكتكوت وحقن صبغة الكربوسيانين DII. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو زرع أنبوب عصبي متبرع مسمى GFP من جنين دجاج معدل وراثيا متطابق مع المرحلة إلى جنين متلقي على مستوى الجسيدات من واحد إلى سبعة ، متبوعا بوضع العلامات على الأوعية الدموية باستخدام صبغة فلورية محبة للدهون. يسمح النهج المشترك بالتصور المباشر للجنين تحت المجهر التجسيمي ، مما يتيح دراسة تكامل الكسب غير المشروع العصبي وتطوير شبكة الأوعية الدموية في البيضة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تطعيم الأنسجة

1. باستخدام ماصة زجاجية دقيقة ، انقل الأنبوب العصبي المقطوع بعناية من زجاج الساعة إلى الجنين المضيف. ضع الأنبوب العصبي في الاتجاه الأمامي الخلفي الصحيح وادفع الأنبوب المخرج برفق بجوار المنطقة المستقرة من مضيف الفرخ باستخدام المشرط الدقيق. اترك جزءا صغيرا من الأديم الظاهر متصلة بالسطح الظهري أو عن طريق قطع شق صغير فيه لتحديد اتجاه الأنبوب العصبي.
   1. إذا لزم الأمر، استخدم المشرط الصغير لقص المنشأة إلى الحجم الدقيق للمنطقة المستقطعة.
2. قم بتوجيه الأنبوب العصبي برفق إلى المنطقة المستعصية ووضعه بحيث يكون الجانب الظهري موجها بشكل صحيح. استخدم ماصة زجاجية دقيقة، مثبتة على أنبوب الفم، لإزالة PBS و/أو السوائل المحيطة بالكسب غير المشروع. هذا يساعد المتبرع والأنسجة المضيفة على الالتصاق وترسيخ الكسب غير المشروع.
3. أغلق النافذة بأكملها بشريط شفاف بعرض 24 مم لمنع الجفاف والتلوث.
4. قم بتسمية الجنين الخيمري عن طريق وضع علامة بقلم رصاص على قشر البيض وسجل رقمه في كتاب المختبر. أعد البيضة إلى الحاضنة لمزيد من التطوير.

2. حقن DiI في الأوعية الدموية للجنين المضيف

1. في النقطة الزمنية التجريبية المطلوبة (هنا ، بعد 3-10 أيام) ، استرجع الجنين الخيمري من الحاضنة وقم بإزالة الشريط الشفاف باستخدام مقص مستقيم للوصول إلى الجنين داخل البويضة.
2. إذا لزم الأمر ، قم بتكبير النافذة في القشرة باستخدام المقص. احرص على عدم إتلاف الغشاء المشيمي إذا كان متصلا بالقشرة ، مما قد يؤدي إلى نزيف وتعريض ملصقات الأوعية الدموية للخطر.
3. اختر وريدا يمكن الوصول إليه على صفار البيض مع التأكد من توجيه تدفق الدم نحو الجنين. اختر نقطة متفرعة لأحد الأوردة الزجاجية (الشكل 1 ب ، ج).
   ملاحظة: في E6.5 - E7.5 ، قد يحتاج الغشاء المشيمي إلى تحريكه برفق جانبا باستخدام ملاقط للوصول إلى أوردة الصفار. بعد E8.5 ، الخيار الوحيد هو الحقن في أحد الأوردة الغشائية المشيمية لأن الغشاء المشيمي يغطي الجنين بالكامل في هذه المرحلة.
4. قم بإزالة غشاء vitelline فوق نقطة الحقن المختارة باستخدام ملاقط Dumont # 5 عن طريق التمزيق في اتجاهين متعاكسين.
5. اكسر إبرة زجاجية مسحوبة باستخدام Dumont # 5 واضبط قطرها على الحجم التقريبي للوريد قبل التحميل باستخدام CellTracker CM-DiI. اصنع محلول مخزون DiI عند 40 ميكروغرام / ميكرولتر في DMSO وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية. قم بإعداد محلول العمل في 0.3 M من السكروز / PBS بتركيز 4 ميكروغرام / ميكرولتر
   1. شفط ما بين 5 - 10 ميكرولتر من DiI في 0.3 M سكروز / PBS في الإبرة باستخدام الشفط بأنبوب الفم. قد تتطلب الأجنة الأكبر سنا ما يصل إلى 25 ميكرولتر أو أكثر. من E8.5 ، تحتوي الأجنة على عروق أكبر وأكثر عضلية ، والتي قد تحتاج إلى تثبيتها في موضعها باستخدام Dumont # 5 قبل الطعن بإبرة زجاجية محملة ب DiI.
6. أدخل الإبرة بسرعة في الوريد وانفخ بثبات بأنبوب الفم للسماح ل DiI بالانضمام إلى تدفق الدم ببطء دون تكوين جلطة. بدلا من ذلك ، استخدم حاقن الضغط لتسليم DiI.

النتائج

فئة الشكل = 'الصورة image_resized image-style-align-center' style='display:table;margin-left;auto;margin-right:auto;width:75٪;'>

الشكل 1. حقن DiI في الوريد. (أ) الأدوات الموصى بها: أ) إسقاط CellTracker CM-DiI على البارافيلم ، ب) إبرة حقن الزجاج المسحوبة ، ج) أنبوب الفم. (ب) رسم تخطيطي لحقن DiI في الوريد في جنين الفرخ الخيمري E4. (ج) في ا...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بيض الكتاكيت المخصبهنري ستيوارت وشركاه ، لاوث ، المملكة المتحدة مبخص بيض كتكوت GFPمرفق الدجاج المعدح وراثيا ، معهد روزلين ، بيضة جامعة إدنبرة حاضنة (Profi-H Hatcher)Lyon Technologies ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية910-033 14C حاضنة حاضنة تبريد دقيقة ، Leec Ltd. ، نوتنغهام ، المملكة المتحدةموديل LT2 مجهر ستيريوLEICAموديل MZ 12.5 كاميرا رقميةLEICADC500 برنامج الحصول على الصورLEICAIM50 مصدر الضوء البارد الهالوجين برقبة أوزةمفاهيم التصوير المتقدمة ، IncKL 1500 LCD أنبوب الفمSIGMA - ALDRICHA5177 ماصات النقل ، البولي إيثيلينSIGMA - ALDRICHZ350796 Dumont # 5 ملقطأدوات العلومالدقيقة 11251-30 دبابيس Minutienأدوات العلوم الدقيقة26002-15 ملقط Dumont AA ، أدوات العلوم الدقيقة المطلية بالإيبوكسي Inox11210-10 Sellotape (واضح ، عرض 24 مم) أي مورد CellTracker CM-DiIمجسات جزيئيةC-7001 الشعيرات الدموية الزجاجية Borosillicate ، thinwall بدون خيوطجهاز هارفاردPY8 30-0035