التصوير في الوقت الحقيقي في المختبر للتفرع المحوري في الخلايا العصبية القشرية للفأر

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Winkle, C. C., et al. استخدام المنهجيات المجمعة لتحديد دور توصيل غشاء البلازما أثناء تفرع المحور العصبي وتكوين الخلايا العصبية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو تقنية التصوير المباشر باستخدام الفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي (DIC) لمراقبة التفرع المحوري في الوقت الفعلي في الخلايا العصبية القشرية. تلتقط مقاطع الفيديو ذات الفاصل الزمني تأثيرات علاج النيترين -1 ، وهو جزيء إشارة يحفز إفراز الخلايا الموضعي وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي في المحاور. تبدأ هذه العمليات نتوءات الغشاء ، والتي تتطور إلى فروع محورية ناضجة ، مما يوفر نظرة ثاقبة على تطور الخلايا العصبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الفحص المجهري بفاصل زمني لتباين التداخل التفاضلي (DIC) لتفرع المحور العصبي

ملاحظة: بينما يستخدم هذا البروتوكول DIC ، يمكن استخدام طرق المجهر الضوئي المرسلة الأخرى لنفس الأغراض (على سبيل المثال: تباين الطور).

في يومين في المختبر (DIV) ، ضع طبق التصوير السفلي الزجاجي الذي يحتوي على خلايا عصبية غير منقولة في غرفة بيئية دافئة مسبقا للحفاظ على بيئة رطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. استخدم مجهرا مزودا بعدسة موضوعية DIC ذات فتحة عددية 60X و 1.4 فتحة عددية (NA) ومكثف NA عالي للحصول على أفضل جودة ودقة للصورة.
اضبط المستوى البؤري للعثور على الخلايا العصبية من خلال العينين باستخدام إضاءة الضوء المنقولة.
باستخدام وظيفة اكتساب المناطق المتعددة في برنامج التصوير ، ابحث عن مواقع XYZ التي لا تقل عن 6 خلايا واحفظها. ضع المسرح بحيث تتناسب الخلايا العصبية ذات الأهمية مع مجال الرؤية للحصول على أفضل النتائج.
1. التحفيز ب 250 نانوغرام/مل نيترين -1 واضغط على "بدء الاستحواذ على مناطق متعددة". احصل على الصور بالتتابع في كل موضع كل 20 ثانية لمدة 24 ساعة ، مع إيقاف الاستحواذ مؤقتا وإعادة التركيز حسب الضرورة.
راجع الصور في برامج التصوير باستخدام Apps>Review Multi Dimensional Data>open file name. تحديد فروع محور عصبي مستقرة (بطول 20 ميكرومتر) تتشكل أثناء جلسة التصوير. استخدم أداة رسم الخط لقياس فرع محور عصبي مستقر من قاعدة المحور العصبي إلى الطرف لضمان استيفاء مؤهلات الطول 20 ميكرومتر.
1. في جدول بيانات ، سجل رقم الإطار بعد تحفيز netrin عندما تبدأ نتوءات الغشاء في المناطق التي تتشكل فيها الفروع لاحقا ، بالإضافة إلى رقم الإطار بعد تحفيز Netrin عندما يصل طول الفروع الناشئة إلى 20 ميكرومتر.
2. اضرب عدد الإطارات بين النتوء وتكوين الفروع في 20 ثانية لحساب وقت التكوين لكل فرع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 35mm Glass Cell Live Imaging Fluors يجب أن تكون مطلية ب 1 ملغ / مل Poly-d-lysine وشطفها قبل خلاياالطلاء Olympus IX81-ZDC2 المجهر المقلوبأوليمبوس لامدا LS مصباح زينون شركة Sutter Instruments شركة المرحلة البيئية الحاضنة العلويةTokai Hit 100x 1.49 NA TIRF الهدفأوليمبوس أندور iXon EM-CCDAndor Odyssey Licor نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراءLI-COROdyssey CL-Xيستخدم ل مسح بقعمجموعة برامج استوديو الصورLI-COR تستخدم للمسح الضوئي على نظام Odyssey Infrared ؛ يستخدم استوديو الصور الخفيف لتحليل البقع في وضع عدم الاتصالالتحول لأجهزة أوليمبوسالجزيئية ، LLCالإصدار 7.7.6.0البرنامج المستخدم لجميع عمليات التصوير وتحليل برنامج التحكم بفاصل زمنيDIC CELL TIRFبرنامج أوليمبوس المستخدم للتحكم في الليزر لتصوير TIRFفيجي (الصورة J) NIHImageJ الإصدار 1.49t 60x خطة Apochromat 1.4 NA الهدفأوليمبوس 40x 1.4 NA Plan Apochromat الموضوعيأوليمبوس وسائط نيوروبازالجيبكو21103-049حل أساسي لكل من وسائط التبريد الخالية من المصل والتربسينمكمل B27GIBCO17504-044500 مل / 50 مل وسائط خالية من المصل ووسائط تبريد التربسينL-Glutamine 35050-0611 مل / 50 مل من الوسائط الخالية من المصلمصل الأبقار الجنينيCorning / CELLGRO35-010-CV محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) Corning / CELLGRO 20-021-CVPoly-D-LysineSigmap-7886

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن