في الجسم الحي تصوير ثنائي الفوتون لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين الفأر

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. في الجسم الحي ، التصوير المزمن ثنائي الفوتون للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام الفئران CX3CR1-GFP

1. بعد تحريض التخدير ، اغسل الجزء الداخلي من الأنبوب المعدني بمحلول ملحي معقم لإزالة الحطام. تأكد من أن الحويصلات الهوائية البيضاء للحصين مرئية من خلال الزجاج (الشكل 1 أ) وأنه لا توجد مضاعفات ، مثل نزيف ما بعد الجراحة.
2. اضبط الماوس تحت المجهر ثنائي الفوتون في الخطوات التالية:
   1. ضع الماوس في جهاز تثبيت الرأس تحت العدسة الموضوعية للمجهر ثنائي الفوتون وفي مرحلة المسح الضوئي XY الآلية. استخدم وسادة تدفئة للدعم الحراري. راقب عمق التخدير واضبطه ، حيث قد يستغرق فحص الجودة هذا ما يصل إلى 30 دقيقة. ملاحظه: يوصى باستخدام العدسة الموضوعية بالغمر في الماء بمسافة عمل أطول من 3 مم وفتحة عددية عالية (NA). يمكن أن يؤدي طوق تصحيح العدسة الشيئية إلى تحسين الدقة عن طريق تعويض عدم تطابق معامل الانكسار بين الزجاج والمواد الحيوية.
   2. املأ الفراغ بين الزجاج والعدسة الموضوعية بالماء ، مع الحرص بشكل خاص على تجنب فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر ، قم بتوسيع مساحة اللوحة المعدنية باستخدام فيلم بلاستيكي ، يحتوي على المزيد من الماء ، لتغطية العدسة الأمامية للهدف بالكامل.
   3. قم بتشغيل ليزر نبضي فيمتو ثانية بطول موجي 920 نانومتر لإثارة مجسات الفلورسنت المعبر عنها في الدماغ وابدأ برنامج الحصول على الصور.
   4. اضبط التركيز البؤري على CA1 (Cornu Ammonis 1) باستخدام المرحلة الآلية ونظام التركيز البؤري الآلي. ضع الهيكل المستهدف بتوجيه من التألق المنبعث من حمة الدماغ والضوء المنعكس من حافة الأنبوب المعدني تحت إضاءة مستمرة بواسطة الليزر النبضي.
   5. قم بقياس أعماق حمة الدماغ التي تلامس الجزء السفلي الزجاجي عن طريق ضبط التركيز باستخدام نظام التركيز البؤري الآلي. قارن الأعماق في مواقع أفقية مختلفة للحكم على محاذاة القاع الزجاجي ومستوى التصوير.
      1. اضبط زاوية رأس الماوس عن طريق إمالة جهاز تثبيت الرأس حتى يتم ضبط الجزء السفلي الزجاجي ليكون موازيا لمستوى التصوير.
   6. اضبط طوق التصحيح للهدف لتحقيق أعلى دقة في عمق الهيكل المستهدف في CA1.
3. تحقق من جودة وشدة الصور التي تم الحصول عليها عن طريق إثارة الفوتون الثنائي للحصين (الشكل 1 ب).
   ملاحظة: يشير تدهور الصورة إلى وجود تلف في الأنسجة داخل الدماغ.
4. تأكد من أن الخلايا الدبقية الصغيرة قد استعادت بالفعل مورفولوجيتها المتشعبة (الشكل 1C).
   ملاحظة: تشير بيانات التصوير للخلايا الدبقية الصغيرة إلى أن هناك حاجة إلى 3-4 أسابيع على الأقل للخلايا الدبقية الصغيرة للعودة إلى حالتها القاعدية.
5. قم بإجراء التصوير في الجسم الحي في أي طبقات من CA1 لغرض معين من التجربة.

الشكل 1: تصوير في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران CX3CR1-GFP في المرحلة المزمنة. (أ) المظهر التمثيلي للنافذة المزروعة على الظهر الأيمن CA1 (Cornu Ammonis 1) في المرحلة المزمنة. من خلال القاع الزجاجي ، لوحظت الألياف البيضاء للحويص الهوائية بوضوح دون نزيف بعد الجراحة. يمكن رؤية DHC و LV جزئيا في المنطقة الذيلية الإنسية وفي الحافة المنقولية الجانبية ، على التوالي. شريط المقياس ، 1 مم (ب) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد التمثيلية من التصوير المزمن CA1 في الجسم الحي لماوس CX3CR1-GFP على POD 24 (العرض: 511 ميكرومتر ، الارتفاع: 511 ميكرومتر ، العمق: 670 ميكرومتر). (ج) تظهر الصور النموذجية للخلايا الدبقية الصغيرة من (B) مع مورفولوجيا متشعبة مستعادة بالكامل على أنها MIPs لمداخن صور GFP بسماكة 20 ميكرومتر على أعماق 100 و 280 و 500 ميكرومتر من سطح الجراحة. قضبان المقياس ، 50 ميكرومتر.