في الجسم الحي تصوير ثنائي الفوتون لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين الفأر

الملخص

المصدر: Kamei، R.، et. al.، في الجسم الحي التصوير المزمن ثنائي الفوتون للخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين الفأر. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح الفيديو عملية الإعداد والتصوير للفحص المجهري ثنائي الفوتون في الجسم الحي لديناميكيات الخلايا الدبقية الدقيقة في الحصين CA1 (Cornu ammonis 1) والتلفيف المسنن ، مما يضمن المحاذاة البصرية المثلى وتقييم السلامة الهيكلية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. في الجسم الحي ، التصوير المزمن ثنائي الفوتون للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام الفئران CX3CR1-GFP

1. بعد تحريض التخدير ، اغسل الجزء الداخلي من الأنبوب المعدني بمحلول ملحي معقم لإزالة الحطام. تأكد من أن الحويصلات الهوائية البيضاء للحصين مرئية من خلال الزجاج (الشكل 1 أ) وأنه لا توجد مضاعفات ، مثل نزيف ما بعد الجراحة.
2. اضبط الماوس تحت المجهر ثنائي الفوتون في الخطوات التالية:
   1. ضع الماوس في جهاز تثبيت الرأس تحت العدسة الموضوعية للمجهر ثنائي الفوتون وفي مرحلة المسح الضوئي XY الآلية. استخدم وسادة تدفئة للدعم الحراري. راقب عمق التخدير واضبطه ، حيث قد يستغرق فحص الجودة هذا ما يصل إلى 30 دقيقة. ملاحظه: يوصى باستخدام العدسة الموضوعية بالغمر في الماء بمسافة عمل أطول من 3 مم وفتحة عددية عالية (NA). يمكن أن يؤدي طوق تصحيح العدسة الشيئية إلى تحسين الدقة عن طريق تعويض عدم تطابق معامل الانكسار بين الزجاج والمواد الحيوية.
   2. املأ الفراغ بين الزجاج والعدسة الموضوعية بالماء ، مع الحرص بشكل خاص على تجنب فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر ، قم بتوسيع مساحة اللوحة المعدنية باستخدام فيلم بلاستيكي ، يحتوي على المزيد من الماء ، لتغطية العدسة الأمامية للهدف بالكامل.
   3. قم بتشغيل ليزر نبضي فيمتو ثانية بطول موجي 920 نانومتر لإثارة مجسات الفلورسنت المعبر عنها في الدماغ وابدأ برنامج الحصول على الصور.
   4. اضبط التركيز البؤري على CA1 (Cornu Ammonis 1) باستخدام المرحلة الآلية ونظام التركيز البؤري الآلي. ضع الهيكل المستهدف بتوجيه من التألق المنبعث من حمة الدماغ والضوء المنعكس من حافة الأنبوب المعدني تحت إضاءة مستمرة بواسطة الليزر النبضي.
   5. قم بقياس أعماق حمة الدماغ التي تلامس الجزء السفلي الزجاجي عن طريق ضبط التركيز باستخدام نظام التركيز البؤري الآلي. قارن الأعماق في مواقع أفقية مختلفة للحكم على محاذاة القاع الزجاجي ومستوى التصوير.
      1. اضبط زاوية رأس الماوس عن طريق إمالة جهاز تثبيت الرأس حتى يتم ضبط الجزء السفلي الزجاجي ليكون موازيا لمستوى التصوير.
   6. اضبط طوق التصحيح للهدف لتحقيق أعلى دقة في عمق الهيكل المستهدف في CA1.
3. تحقق من جودة وشدة الصور التي تم الحصول عليها عن طريق إثارة الفوتون الثنائي للحصين (الشكل 1 ب).
   ملاحظة: يشير تدهور الصورة إلى وجود تلف في الأنسجة داخل الدماغ.
4. تأكد من أن الخلايا الدبقية الصغيرة قد استعادت بالفعل مورفولوجيتها المتشعبة (الشكل 1C).
   ملاحظة: تشير بيانات التصوير للخلايا الدبقية الصغيرة إلى أن هناك حاجة إلى 3-4 أسابيع على الأقل للخلايا الدبقية الصغيرة للعودة إلى حالتها القاعدية.
5. قم بإجراء التصوير في الجسم الحي في أي طبقات من CA1 لغرض معين من التجربة.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image-style-align-center image_resized' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto؛ width: 75٪;'>

الشكل 1: تصوير في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران CX3CR1-GFP في المرحلة المزمنة. (أ) المظهر التمثيلي للنافذة المزروعة على الظهر الأيمن CA1 (Cornu Ammonis 1) في المرح...

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-resized'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ليزر نابض فيمتو ثانيةSpectra-PhysicsMaiTai Deep SeeA Ti: ليزر الياقوت المستخدم بطول موجي 920 نانومتر.مجهر ثنائي الفوتوننيكونA1R MP + مجهر للتصوير CA1.عدسة موضوعية لتصوير ثنائي الفوتونأوليمبوسXLPLN25XSVMP25× الهدف مع مسافة عمل طويلة, فتحة عددية عالية, وطوق تصحيحألواح الألومنيومNarishigeCP-1لوحات مصنوعة من الألمينوم لتثبيت الرأس.أغطية زجاجية دائريةMatsunami Glass3φ No.1Coverslips مرتبطة بأنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ.الفئران CX3CR1-GFPمختبر جاكسون8451الفئران المعدلة وراثيا للتصوير الدبقي الصغير.أنابيب أسطوانية من الفولاذ المقاوم للصدأMORISHITA أنابيب معدنية مصنوعة حسب الطلبليتم زرعها. القطر الخارجي 3.0 مم ، القطر الداخلي 2.8 مم ، الارتفاع 1.7 مم.أسمنت راتنج الأسنان (سوبر بوند C & B) صن ميديكال204610555أسمنت الأسنان.جهاز تثبيت الرأسNarishigeMAG-2جهاز تثبيت رأس الفئران مع أدوات ضبط الزاوية وسادة التدفئةمركز الأبحاث الحيويةBWT-100A و HB-10لتوفير الدعم الحراري للفأر أثناء الجراحة.وسادة تسخينALA ScientificHEATINGPAD-1 و Hot-1Tools لتوفير الدعم الحراري للماوس على جهاز تثبيت الرأس.الكيتامين (كيتالار) شركة Daiichi SankyoS9-001665التخدير أثناء الجراحة.مرهم العيونساتو الصيدلانية يستخدم لمنع جفاف العين أثناء الجراحة.محلول فرك بوفيدون اليودMeiji Seika Pharma2612701Q1137يستخدم لتطهير موقع الجراحة.مجاهر ستيريومجاهر لايكا مايكروسيستمزS8 APOللجراحة.مصنع أوتسوكا للأدوية الملحية المعقمة3311401A2026محلول الغسيل أثناء الجراحة.وسادة معقمة مقاومة للماءAS ONE8-5945-01منصة جراحية.زيلازين (Celactal 2٪)تخدير باير أثناء الجراحة.