$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
تم إجراء تجارب على مستحضرات الأعصاب والعضلات المعزولة للرافعة الرافعة الطويلة (م. LAL) من الفئران BALB / C (20-23 جم ، 2-3 أشهر).
1. تحضير محاليل Ringer و File
- قم بإعداد محلول Ringer لعضلات الثدييات عن طريق خلط المكونات التالية: كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم (137 مليمتر) ، كلوريد البوتاسيوم ، كلوريد الكالسيوم (5 ملليمتر) ، كلوريد الكالسيوم2 (2 ملليمتر) ، كلوريد المغنيد2 (1 ملليمتر) ، هيدروهيدروكسيدالصوديوم 2PO4 (1 ملليمتر) ، هيدروكسيد الصوديوم3 (11.9 مليمتر) ، والجلوكوز (11 ملليمتر). قم بإخراج المحلول بنسبة 95٪ أكسجين (O2) و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2) واضبط درجة الحموضة على 7.2-7.4 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك / هيدروكسيد الصوديوم (HCl / NaOH) إذا لزم الأمر.
- تحضير محلول تحميل الصبغة.
- تحضير (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) (10 mM) مع الرقم الهيدروجيني في نطاق 7.2-7.4. 500 ميكروغرام من الصبغة التجارية تأتي في قارورة 500 ميكرولتر. قم بإذابة الصبغة في 14 ميكرولتر من محلول HEPES للحصول على تركيز صبغة يبلغ 30 ملم. يرج جيدا وجهاز الطرد المركزي حتى يذوب تماما.
- قم بتخفيف محلول مؤشر Ca2+ بمحلول HEPES حتى تركيز 1 مليمول. احتفظ بها في الفريزر (-20 درجة مئوية) وتجنب التعرض للضوء.
2. إجراء تحميل الصبغة
ملاحظة: يتم تنفيذ إجراء تحميل الصبغة وفقا لبروتوكول التحميل من خلال جذع العصب ، مقتبس من البروتوكولات المنشورة سابقا.
- قم بتشريح عضلة LAL وفقا لإجراء التشريح لهذا المستحضر كما هو موضح في البروتوكولات المنشورة سابقا.
- قم بتثبيت الأنسجة المشدودة قليلا (لا تزيد عن 30٪ من الطول الأولي) في طبق بتري المطلي باللدائن باستخدام دبابيس ناعمة من الفولاذ المقاوم للصدأ وأضف محلول Ringer حتى يتم تغطية العضلة بالكامل.
ملاحظة: تم ملء طبق بتري مسبقا بالمطاط الصناعي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد ماصة التعبئة
- باستخدام مجتذب ماصة دقيقة (انظر جدول المواد)، قم بإعداد ماصة دقيقة ذات طرف رفيع حاد قدر الإمكان للتسجيلات داخل الخلايا. استخدم الشعيرات الدموية بدون خيوط داخلية (1.5 مم في القطر الخارجي و 0.86 أو 1.10 مم في القطر الداخلي).
- اقطع طرف الماصة الدقيقة بعد تسجيل المستدق بمادة كاشطة ، مع ترك الطرف مفتوحا بقطر حوالي 100 ميكرومتر. قم بتلميع الطرف لأسفل للحد عندما يتقلص القطر الداخلي من >80 ميكرومتر إلى 12-13 ميكرومتر. قم بتوصيل أنبوب سيليكون بجانب واحد من ماصة التعبئة وحقنة (بدون إبرة) على الجانب الآخر.
- تحت المجهر المجسم ، ابحث عن المكان الذي يتحول فيه جذع العصب إلى فروع عصبية منفصلة. ضع ماصة الحشو مع الأنبوب المركب والحقنة على طبق بتري باستخدام الشمع. حرك طرف الماصة حتى يقف فوق العصب.
- باستخدام مقص ناعم ، اقطع العصب بالقرب من الألياف العضلية ، تاركا قطعة صغيرة من جذع العصب يبلغ طولها حوالي 1 مم. قم بشفط جذع العصب برفق مع بعض محلول Ringer ، دون الضغط عليه ، في طرف ماصة التعبئة. قم بإزالة أنبوب السيليكون من ماصة التعبئة.
- ارسم كمية من محلول تحميل الصبغة (~ 0.3 ميكرولتر) باستخدام حقنة ذات خيوط طويلة. يتوافق هذا الحجم مع حوالي 3 سم من الفتيل.
ملاحظة: في البداية ، من الضروري عمل خيوط من طرف ماصة بحجم 10 ميكرولتر عن طريق سحب النار باستخدام مصباح كحول أو موقد غاز. - أدخل طرف الفتيل برفق مع محلول التحميل في ماصة التعبئة. حرر الخليط مباشرة على جذع العصب. احتضان المستحضر في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
- بعد ذلك ، اشطف المستحضر بمحلول Ringer الطازج واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة تصل إلى ساعتين في دورق زجاجي مع 50 مل (أو أكثر) محلول Ringer (يجب تغطية المستحضر بالمحلول). خلال هذا الوقت ، ستصل الصبغة إلى نقاط الاشتباك العصبي.
3. التقاط الفيديو باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر
ملاحظة: يتم تسجيل عابرات الكالسيوم باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر (LSCM) (انظر جدول المواد). لتسجيل عابرات الكالسيوم السريعة ، تم استخدام بروتوكول أصلي يسمح بتسجيل الإشارات ذات الدقة المكانية والزمانية الكافية. تم تجهيز المجهر بهدف الغمر في الماء 20x (فتحة عددية 1.00 (NA)). تم تخفيف خط الليزر 488 نانومتر إلى شدة 10٪ ، وتم جمع مضان الانبعاث من 503 إلى 558 نانومتر.
- قم بتركيب المستحضر في الغرفة التجريبية المطلية بالسيليكون المطاط الصناعي وقم بإصلاحه ، ممتدا قليلا ، بمجموعة من الإبر الدقيقة الفولاذية. اشطف المستحضر على نطاق واسع باستخدام محلول Ringer.
NOTE: تم استخدام غرفة تجريبية بسيطة مصنوعة خصيصا من الزجاج العضوي مع تغطية قاع الغرفة بالمطاط الصناعي (محضر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ؛ انظر جدول المواد). تحتوي الغرفة على أنبوب إمداد محلول. يتم ضخ المحلول عبر إبرة حقنة ، مثبتة على حامل مغناطيسي (انظر جدول المواد). كغرفة تجريبية ، يمكن استخدام طبق بتري (مثل الطبق المستخدم في حضانة المستحضر) ، ولكن مع أنابيب إمداد وشفط مرفقة. - قم بتركيب قطب شفط ، والذي سيتم استخدامه لتحفيز العصب.
ملاحظة: ضع القطب الكهربائي وثبته عن طريق إزالة الشعر بالشمع بجانب الحمام. حرك الطرف بالقرب من جذع العصب وشفطه في القطب. - قم بتركيب غرفة التحضير على مرحلة المجهر وضع تركيبات المدخل والمخرج في الغرفة.
- لنشر المستحضر ، استخدم نظاما بسيطا مدفوعا بتدفق الجاذبية. قم بتشغيل مضخة شفط التروية لإزالة المحلول الزائد.
- قم بتوصيل قطب الشفط المحفز بمحفز كهربائي وتأكد من حدوث تقلصات عضلية بعد التحفيز. انظر الأقسام 3.9-3.12 للاطلاع على ظروف التحفيز والتسجيل.
- املأ نظام التروية بمحلول Ringer ب d-tubocurarine (10 μM).
ملاحظة: يساعد هذا الحل على منع الانقباضات العضلية. من شأن حاصرات D-tubocurarine أو alpha-bungarotoxin الخاصة بمستقبلات أستيل كولين النيكوتين على الغشاء التالي المشبكي أن تمنع تقلصات العضلات كليا أو جزئيا50. أيضا ، لمنع الانقباضات العضلية ، يمكن استخدام حاصرات محددة لقنوات الصوديوم بعد المشبكي مثل μ-conotoxin GIIIB 51. - قم بتشغيل مضخة شفط التروية وابدأ نضح المستحضر بمحلول Ringer الذي يحتوي على d-tubocurarine.
- قم بتعيين معلمات التصوير في برنامج LSCM على النحو التالي.
- في برنامج LSCM (LAS AF ؛ انظر جدول المواد) ، اختر الفيزيولوجيا الكهربية.
ملاحظة: في هذا الوضع ، عندما يتم التقاط صورة في النقطة الزمنية ، يتم إرسال نبضة مزامنة إلى المحفز بمساعدة مربع الزناد. هذا يثير توليد جهد الفعل في التحضير (الشكل 1 ؛ وحدة المحفز). - حدد وضع الاكتساب. لتشغيل المحفز باستخدام نبضة مزامنة المجهر، في إعدادات قائمة الوظيفة، حدد إعدادات المشغل. قم بتعيين حقل Trigger Out On Frame إلى القناة out1.
- استخدم الإعدادات التالية: وضع المسح: XYT، تردد المسح: 1400 هرتز، عامل التكبير: 6.1، الثقب: مفتوح بالكامل. تأكد من تشغيل وضع X ثنائي الاتجاه عبر التمرير المتسلسل.
- قم بتعيين الحد الأدنى للوقت لتشكيل إطار عند 52 مللي ثانية والإطارات التي سيتم جمعها في فيديو خام بمعدل 20 إطارا.
ملاحظة: تسمح هذه الإعدادات بالتقاط الصور بدقة 128 × 128 بكسل مع التقاط إطار واحد كل 52 مللي ثانية. - اضبط الطول الموجي للإثارة لليزر الأرجون على 488 نانومتر مع 8٪ من طاقة الإخراج.
اضغط على زر الوضع المباشر للتبديل إلى الوضع المباشر، مما يساعد على الحصول على معاينة للأطراف العصبية المحملة بالصبغة.
- وحدة التحفيز
ملاحظة: يسمح هذا الجهاز بتعيين المعلمات الزمنية للتحفيز عبر برنامج MATLAB.- قم بإنشاء ملف جديد ، والصق الكود من المقالة المذكورة أعلاه في نافذة كود MatLab ، واحفظ الملف. انقر فوق تشغيل ، لذلك تظهر نافذة بها معلمات التحفيز. اضبط وقت التأخير ومدة التحفيز.
ملاحظة: يحدد التأخير الدقة الزمنية لإشارة الفلورسنت المعاد تكوينها. يتم تأخير النبضة الكهربائية لمدة 0.2 مللي ثانية ثم إرسالها إلى وحدة العزل. يشكل هذا الأخير سعة وقطبية النبضة المحفزة ويعزل الجسم البيولوجي كهربائيا عن معدات التسجيل. - لتحفيز العصب ، حدد السعة فوق القصوى للنبضة المحفزة (25٪ -50٪ أكبر من أقصى شدة تحفيز ضرورية لتنشيط جميع الألياف العصبية).
ملاحظة: تعتمد الطريقة المقدمة على خوارزمية خاصة لتسجيل إشارات الفلورسنت السريعة المفردة باستخدام LSCM مع اكتساح مصغر. في كل خطوة من خطوات الخوارزمية المطورة ، يتم تحويل إشارة الفلورسنت المسجلة من الإشارة السابقة بفاصل زمني أقصر من مسح المجهر. تحدد قيمة التحولات الزمنية الاستبانة الزمنية للإشارة المطلوبة. يعتمد عدد الخطوات (التحولات) في الخوارزمية على الدقة الزمنية المطلوبة والدقة الزمنية الأصلية. باستخدام طريقة التسجيل هذه ، يتم تحفيز المستحضر بتردد 0.25 هرتز.
- في الوضع المباشر ، ابحث عن عائد الاستثمار واحصل على أفضل تركيز. قم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات.
- قم بتحويل التأخير على المحفز بمقدار 2 مللي ثانية أقل بالنسبة للقيمة السابقة وقم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات.
- كرر الخطوة 3.11 26 مرة للحصول على 26 تسلسلا ، مع إزاحة كل تسلسل بمقدار 2 مللي ثانية من التسلسل السابق.
