توصيل الأدوية العلاجية العصبية القائمة على المضخة التناضحية في نموذج فأر مزيل الميالين

الملخص

المصدر: Wang، X. et al.، توصيل الأدوية القائم على المضخة التناضحية لأبحاث إعادة الميالين في الجسم الحي على الجهاز العصبي المركزي. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو طريقة توصيل الأدوية العلاجية العصبية باستخدام مضخة تناضحية في نموذج فأر منزوع الميالين. يعزز إطلاق الدواء الخاضع للرقابة إعادة الميالين عن طريق تنشيط الخلايا المنتجة للمايلين في الجسم الثفني.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إنشاء نموذج فأر إزالة الميالينة الناجم عن الليسوليسيثين

1. تحضير محلول 1٪ ليسوليسيثين (ويسمى أيضا L-α-Lysophosphatidylcholine) مع محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
2. تعقيم المقص والملقط والمرقئ المنحني والأدوات الجراحية الأخرى عن طريق التعقيم بالأوتوكلاف. تعقيم المنطقة الجراحية ووضع أوراق معقمة. يجب تحضير جميع المواد والكواشف المستخدمة في الجراحة بشكل معقم. من المهم الحفاظ على منطقة الجراحة معقمة طوال العملية.
3. تخدير فأر ما بعد الولادة 56 (P56) C57BL6 على النحو التالي.
   1. ضع الماوس في غرفة الأيزوفلوران في آلة تخدير الصغيرة. اضبط تدفق O₂ على 300-500 مل / دقيقة والأيزوفلوران على 3٪ -4٪. بعد التخدير الكافي ، عندما يصبح الفأر غير متحرك مع نفس بطيء ومستقر ، انقل الماوس إلى الجهاز التجسيمي باستخدام وسادة تدفئة.
   2. قم بتبديل إخراج الغاز من الغرفة إلى قناع التخدير واضبط الأيزوفلوران على 1٪ -1.5٪ للحفاظ على الماوس في حالة التخدير. انتظر حتى يتم تخدير الفأر بالكامل ، ثم حقن الكيتوبروفين (3-5 مجم / كجم) داخل الصفاق لتخفيف الألم. قبل العملية ، اضغط على أصابع الفأر وتحقق من رد فعلها لتأكيد التخدير الناجح.
   3. عندما يتم تخدير الفأر ، لا يمكنه تنظيم درجة حرارة جسمه. لذلك ، راقب ونظم درجة حرارة جسم الفأر أثناء الجراحة. قم بتغطية سطح مقل عيون الفأر بمرهم العين الإريثروميسين للحفاظ على رطوبة مقل العيون أثناء التخدير.
4. قم بتأمين رأس الماوس في الجهاز التجسيمي باستخدام قضيب الأسنان وقضبان الأذن. (الشكل 1 أ).
5. استخدم ماكينة حلاقة لإزالة الشعر من أعلى الرأس. تعقيم جلد الرأس بثلاث دورات من البيتادين و 75٪ إيثانول. للمخاوف الأخلاقية ، قم بتغطية جسم باستثناء موقع الجراحة. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق سهمي متوسط بطول 1 سم للجلد من قاعدة الرقبة إلى ما بين العينين لكشف الجمجمة (الشكل 1 ب).
6. امسح سطح الجمجمة برفق بقطعة قطن معقمة تحتوي على 30٪ بيروكسيد الهيدروجين لتصور خيوط الجمجمة (الشكل 1 ج). اضبط ارتفاع شريط السن وقضبان الأذن لوضع نقطة لامدا ونقطة بريجما على نفس الارتفاع (على سبيل المثال ، بنفس إحداثيات المحور z عندما يلامس طرف الإبرة النقاط) ، بحيث تكون الخيط السهمي أفقيا.
7. ضع طرف إبرة حقنة الميكرولتر برفق (10 ميكرولتر ، 33 جم) عند نقطة بريجما وأعد ضبط إحداثيات x و y و z إلى 0 (الشكل 1 د). انقل المحقنة إلى موقع الحقن (x: 1.04 ؛ y: 1.0 ، أي 1.04 مم جانبيا إلى خط الوسط و 1.0 مم خلف نقطة بريجما) وفقا لموجه القراءة الرقمية (الشكل 1E).
8. قم بحفر ثقب صغير ببطء من خلال الجمجمة في موقع الحقن دون اختراق الجافية بإبرة حقنة سعة 1 مل (26 جم ، 0.45 مم) (الشكل 1F). أدخل إبرة حقنة الميكرولتر ببطء في أنسجة المخ من خلال الفتحة حتى يتم الوصول إلى عمق معين (z = -1.62 مم لمعظم الفئران P56) (الشكل 1G).
   ملاحظة: تجريبيا ، يسمح عمق الإدراج البالغ -1.62 مم لطرف الإبرة بالوصول إلى منتصف الجسم الثفني لمعظم الفئران P56 بحيث يمكن توصيل الليسولسيثين مباشرة إلى الجسم الثفني للحث على إزالة الميالين.
9. حقن 1.5 ميكرولتر من 1٪ ليسوليسيثين بسرعة 0.3 ميكرولتر / دقيقة. بعد الحقن ، انتظر لمدة 5 دقائق قبل سحب حقنة الميكرولتر ببطء لمنع تسرب السائل على طول مسار إبرة الحقن.
قم
10. بخياطة الجلد ب 5-0 خيوط جراحية (الشكل 1H).
11. ضع الماوس على وسادة تدفئة لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. يتم إعطاء حقنة تحت الجلد بمقدار 5 ملغ/كغ من الكاربروفين كل 24 ساعة لتخفيف الألم. ضع مرهم الإريثروميسين على الشق كل يوم للتأكد من أن الجرح يلتئم بشكل صحيح. ضع الفأر الذي خضع لعملية جراحية في قفص بمفرده وأطعمه بالطعام الرطب حتى يتعافى تماما. راقب الماوس يوميا بعد العملية.

2. تحضير المضخة التناضحية

ملاحظة: المكونات الرئيسية للمضخة موضحة في الشكل 2 أ.

1. تحديد عمق إدخال قنية ضخ الدماغ في الدماغ. تأكد من أن إبرة قنية تسريب الدماغ المستخدمة يبلغ طولها 3 مم ، وأن كل فاصل لضبط العمق هو 0.5 مم. لتحقيق عمق حقن يبلغ 1.5 مم (بالقرب من الثفن) ، قم بإرفاق ثلاثة فواصل لضبط العمق بإبرة قنية تسريب الدماغ بمادة لاصقة للأنسجة (الشكل 2 ب ، ج).
2. لملء المضخة التناضحية ، قم بتوصيل إبرة المحقنة التي تأتي مع عبوة المضخة بحقنة سعة 1 مل وشفط الدواء. أمسك المضخة في وضع مستقيم ، وأدخل المحقنة في الفتحة الموجودة أعلى المضخة ، وحقن الدواء ببطء ، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات (انظر الشكل 2 د). عندما يتدفق السائل من الفتحة ، اسحب المحقنة ببطء.
3. قم بإزالة الحافة البيضاء من منظم التدفق باستخدام مقص أو كماشة مع الحرص على عدم ثني أو سحق وسيط التدفق. ثم أدخل وسيط التدفق في المضخة (الشكل 2E). لتحديد ما إذا كانت هناك فقاعات في المضخة التناضحية ، قم بوزن المضخة التناضحية بشكل منفصل قبل وبعد التعبئة.
4. قم بقص القسطرة بطول معين وفقا لحجم (قسطرة 20-25 مم للفئران P56 التي تزن حوالي 25 جم). قم بتوصيل القسطرة بقنية تسريب الدماغ.
5. املأ القسطرة بالأدوية باستخدام المحقنة دون إدخال الهواء (الشكل 2F).
6. قم بتوصيل القسطرة بوسيط التدفق. بعد التثبيت ، تأكد من أن القسطرة تغطي حوالي 4 مم من وسيط التدفق المكشوف (الشكل 2G).
7. للتأكد من أن المضخة التناضحية يمكن أن تعمل على الفور بعد الزرع ، اغمر المضخات المملوءة في محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ أو PBS عند 37 درجة مئوية لمدة 4 إلى 6 ساعات على الأقل (يفضل أن تمتد إلى الليل) لترطيب الغشاء شبه المنفذ مسبقا على سطح المضخة بمحاليل لها نفس الضغط الاسموزي مثل بيئة الأنسجة (الشكل 2H).
8. يجب أن تكون جميع المحاليل المحملة في المضخات معقمة. يتم توفير مضخات ALZET معقمة ، بعد تعرضها لجرعة معقمة من الكوبالت 60. ومع ذلك ، في حالة حدوث تلوث خارجي ، يمكن تنظيف سطح المضخة عن طريق مسحه بكحول الأيزوبروبيل (70٪ في الماء).

3. زرع المضخة التناضحية

1. انتظر لمدة 3 أيام بعد إنشاء نموذج إزالة الميالين من الجسم الثفني. قم بتشغيل نظام تخدير الصغيرة. تطهير المقص والملاقط والكماشة المرقئة وانقعها في محلول كحول بنسبة 75٪. ضع صفائح معقمة في منطقة الجراحة.
2. تخدير الفئران وتأمينها على الجهاز التجسيمي مرة أخرى. غطي سطح مقل العيون بمرهم العين لمنع الجفاف.
3. تطهير الجرح الأصلي بالكحول بنسبة 75٪. افتح الشق الجراحي الذي تم خياطته مسبقا (الشكل 3 أ) وقم بتوسيع الشق إلى لوحي الكتف (الشكل 3 ب).
4. افصل الجلد عن النسيج الضام تحت الجلد باستخدام كماشة مرقئة أو ملاقط في لوح الكتف لفتح تجويف (الشكل 3 ج). ضع المضخة التناضحية في التجويف (الشكل 3D ، E).
5. باستخدام قطعة قطن ، امسح برفق وكشف الثقب الموجود على سطح الجمجمة الذي تم إنشاؤه عند إنشاء نموذج إزالة الميالين (انظر الخطوة 1.8). أدخل قنية تسريب الدماغ من خلال هذا الثقب بشكل عمودي وثبته على الجمجمة بسرعة باستخدام لاصق الأنسجة (الشكل 3F).
6. قم بإزالة علامة التبويب القابلة للإزالة فوق قنية تسريب الدماغ بمقص (الشكل 3G ، H). بدلا من ذلك ، قم بإزالة اللسان أولا قبل إدخال القنية لتجنب الاهتزاز أثناء هذه العملية.
قم
7. بغرزة الشق أو إرفاقه بمادة لاصقة للأنسجة (الشكل 3I).
8. بعد الجراحة، ضع الماوس على وسادة تدفئة لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. يتم إعطاء حقنة تحت الجلد بمقدار 5 ملغ/كغ من الكاربروفين كل 24 ساعة لتخفيف الألم. ضع مرهم الإريثروميسين على الشق كل يوم للتأكد من أن الجرح يلتئم بشكل صحيح. ضع في قفص بمفرده وأطعمه بالطعام الرطب حتى يتعافى تماما.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image_resized image-style-align-center' style='display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75٪;'>

الشكل 1: إنشاء نموذج فأر إزالة الميالين الناجم عن الليزوليسيثين. (أ) قم بتأمين الماوس في الجهاز التجسيمي. (ب) افتح شق منتصف السهمي بطول 1 سم لكشف الجمجمة. (ج) تصور خيوط الجمجمة. (د) إعادة ت...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Anesthesia Air pumpRWDR510-29E05818-006طقم تسريب الدماغ 3ALZET88511-3 ممكاربروفينماكلينC830557-1 جم5 مجم / كجم كل 24 ساعةعين الإريثروميسين مرهمجنبا إلى جنب مع التكنولوجياYCKJ-RJ-024780تغطية سطح مقل العيون أثناء التخديرمرهم الإريثروميسينpythonbioRG180 جهاز تفريغ الغازRWDR546WE05518-002L-α-lysophosphatidylcholineSigmaL0906يذوب بنسبة 1٪ معحقنة PBS Microliter معقمة هاميلتون65460-05سلسلة المحاقن: 1700 ، 10 ميكرولتر ، 33 مقياسمضخة التناضح الدقيقة موديل 1002ALZET43170.25 ميكرولتر في الساعة ، 14 يوماPBS (الرقم الهيدروجيني = 7.3) ORIGENEZLI-9061 Pentobarbital الصوديومشنغهاي CiviCAS رقم: 57-33-0150-200 مجم / كجم حقن داخل الصفاق للقتل الرحيمآلة تخدير الصغيرةRWDR520IEE05807-006 Mمعدات التجسيمRWDE06382 STERI 250 معقمKeller31101التعقيم السريع للأدوات الجراحيةخيوط جراحيةشنغهاي جينهوانF5045-0إبرة حقنة (1 مل)شنغهاي KDL6930197811018مقياس 26 (0.45 مم × 16 مم)اختبار الأدوية والمذيباتيعتمد على التجربةN / A نظام المراقبة الحرارية المنزلية ThermostarRWD69026الحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء التخديرلاصق الأنسجة Vetbond3M1469SBتأمين قنية تسريب الدماغ ، والتمسك بشق الجلد