توصيل مركب اختبار داخل القراب إلى الجهاز العصبي المركزي للفئران

الملخص

المصدر: Chen، Y.، et al. توصيل داخل القراب من قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى في الجهاز العصبي المركزي للفئران. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو توصيل مركب اختبار إلى السائل الدماغي النخاعي (CSF) من خلال قسطرة مزروعة في العمود الفقري القطني لنموذج الفئران. يدور المركب على طول السائل الدماغي النخاعي إلى الدماغ والحبل الشوكي ، ويدخل الخلايا العصبية ، ويوفر إمكانات علاجية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الجراحة

1. باستخدام الجرذ المدعوم بالأنبوب المخروطي سعة 50 مل ، حدد الحفرتين الطبيعيتين بين العضلات فوق الحوض (الأسهم في الشكل 1 أ). بيد واحدة تمسك تلك الحفر ، استخدم اليد الأخرى للضغط برفق على العمود الفقري والشعور به من الذيلية إلى الاتجاه المنقاري والعثور على أول مسافة بادئة رئيسية بين الفقرات ، وهذه هي المسافة الفقرية بين الفقرات العجزية 1 (S1) وأسفل الظهر 6 (L6) (الشكل 1 ب).
2. تحرك قليلا لتحديد المسافة البادئة التالية ، والمسافة الفقرية بين الفقرات القطنية 5 (L5) و L6 ، وموقع الحقن (* في الشكل 1 أ). استخدم مشرطا لعمل شق لا يزيد طوله عن 2 سم في الجلد على طول خط الوسط من المنقاري إلى الذيلي بحيث يكون موقع الحقن في وسط الشق (الخط المنقط في الشكل 1 أ).
3. استخدم مقص التشريح لتشريح النسيج الضام لتصور طبقة العضلات. بعد ذلك ، قم بعمل شق 1 سم في كبسولة العضلات على الفور إلى عملية العمود الفقري الظهري للفقرة القطنية L6.
   ملاحظة: يمكن تصور عظام الفقرة القطنية L6 في هذه المرحلة.
4. ضع مجموعة إبرة قنية التوجيه بالقرب من الجانب الأمامي للفقرة القطنية السادسة وادفعها إلى الفضاء الفقري على طول الجانب الأمامي للفقرة السادسة بحيث تخترق نهاية الإبرة القناة الشوكية. ادفع قنية التوجيه في مكانها على طول الإبرة وقم بإزالة الإبرة 23-G ، مع ترك قنية التوجيه فقط في مكانها.
   ملاحظة: من المفيد استخدام ملقط حاد لتحديد موقع العملية الظهرية للفقرة القطنية L6 قبل إدخال الإبرة. بشكل عام ، يمكن رؤية سائل السائل النخاعي (CSF) وهو يدخل محور الإبرة (قد يكون هذا السائل مشوبا بلمحة من الدم ، لكن هذا لا يشير إلى حدوث ضرر أو أن الإبرة لم يتم وضعها بشكل صحيح). لم ير المؤلفون كمية كبيرة من الدم أو نزيف حاد أثناء هذا الإجراء. في حالة حدوث أي منهما ، يجب الاتصال بطبيب بيطري لتحديد العلاج المناسب وما إذا كان يجب القتل الرحيم للحيوانات.
5. أدخل مجموعة أسلاك القسطرة في قنية التوجيه. قم بزاوية مجموعة سلك القسطرة بزاوية 45 درجة تقريبا على القناة الشوكية وأجبر النهاية حوالي 0.3 سم في القناة الشوكية.
6. قم بإزالة قنية التوجيه ، واترك القسطرة مع سلك النمط في مكانه. قم بإزالة سلك النمط على بعد حوالي 2.5 سم من الطرف داخل القسطرة للقسطرة وقم بدفع القسطرة إلى القناة الشوكية حتى تكون علامة 2 سم عند مدخل القناة (مرئية أسفل العضلة مباشرة) ، كما هو موضح في الشكل 2Bvi.
   ملاحظة: يجب أن تمتد القسطرة التي تم إدخالها بشكل منحرف إلى الفراغ تحت العنكبوتية. يجب أن يسمح التنسيب الناجح للقسطرة بالتحرك بحرية في تلك المساحة.
7. اسحب سلك النمط بالكامل ، وقد يظهر السائل الدماغي النخاعي يدخل القسطرة المزروعة.
8. قم بتوصيل مجموعة قسطرة التوصيل بالطرف البعيد من القسطرة المزروعة عبر طرف الإبرة 30 G (الشكل 2Bv ، vi).
9. قم بتحميل 60 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم في حقنة سعة 100 ميكرولتر (حقنة التنظيف). قم بتحميل بلعة من 30 ميكرولتر من مركب الاختبار (على سبيل المثال ، قليل النوكليوتيد المضاد للمعنى أو محلول ASO) في حقنة ثانية (حقنة حقن).
10. قم بتوصيل حقنة التنظيف (المحملة بالمحلول الملحي) بنهاية محول الأنبوب لمجموعة قسطرة التوصيل (الشكل 2Bv). حقن 20 ميكرولتر من محلول ملحي معقم في الفراغ داخل القراب (التنظيف قبل الحقن).
11. قم بتوصيل حقنة الحقن (المحملة بمركب الاختبار) بنهاية محول الأنبوب لمجموعة قسطرة التوصيل (الشكل 2Bv). حقن 30 ميكرولتر من مركب الاختبار في الفضاء داخل القراب على مدى 30 ثانية.
    ملاحظة: حجم الحقن الروتيني ل ASO هو 30 ميكرولتر لتحقيق ضربة قاضية جيدة في النخاع الشوكي وفي القشرة. تم الإبلاغ عن أن أحجام الحقن قد تؤثر على التوزيع المركب ، على الرغم من عدم اختبار أحجام الحقن المختلفة. إذا تم استخدام مركب أو حجم آخر ، فيجب تحديد السلامة والفعالية تجريبيا.
12. كرر الخطوة 1.10 واغسل القسطرة ب 40 ميكرولتر أخرى من محلول ملحي معقم (تنظيف بعد الحقن). ثم افصل مجموعة قسطرة التوصيل عن القسطرة المزروعة.
    ملاحظة: يعتقد أن التدفق قبل وبعد الحقن يقلل من العزل الموضعي للمركبات ويحسن توزيعها على الهياكل المنقارية.
13. لقطع القسطرة المزروعة وإغلاقها بالحرارة ، ضع زوجا من ملقط التشريح المعقم في معقم الخرز حتى يصبح ساخنا جدا ، ثم قم بتضييق الخناق على الأنبوب بالطرف الساخن من الملقط.
    ملاحظة: هذا الإجراء يذوب القسطرة. وبالتالي ، ينهار الثقب الموجود في الأنبوب ، وتلتصق جميع الجوانب ببعضها البعض ، مما يؤدي إلى إغلاق الأنبوب بطريقة معقمة. ثم يتم وضعها في الفضاء تحت الجلد.
14. استخدم خيوط أحادية الشعيرات القابلة للامتصاص لتثبيت القسطرة المتبقية محكمة الغلق بالحرارة في النسيج الضام. بعد ذلك ، استخدم خيوط أحادية الشعيرات غير القابلة للامتصاص لإغلاق الجلد فوق القسطرة الآمنة محكمة الغلق بالحرارة.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام مشابك الجرح على النحو المعتمد من قبل بروتوكول لجنة رعاية المؤسسي واستخدامه (IACUC). هذه التقنية متوافقة مع الحقن المتكرر ، على الرغم من أنها استخدمت فقط للحقن لمرة واحدة في أيدينا. يجب تقييم جدوى الحقن المتكرر تجريبيا بموافقة IACUC.
15. استخدم الشاش والمحلول الملحي لغسل أي دم من الجلد والسماح للحيوان بالتعافي من التخدير في حاضنة ساخنة حتى يصبح متحركا ، وعند هذه النقطة يتم إعادته إلى قفص منزله (فأران لكل قفص).
    ملاحظة: عند إجراء عمليات جراحية على فئران متعددة في نفس اليوم ، قم بتنظيف الأدوات باستخدام الماء لإزالة الدم وإعادة التعقيم باستخدام معقم حبة جافة ساخن (لمدة 20 ثانية على الأقل ، مع الوقت لتبرد) بين. يتم استخدام مجموعة جديدة من الأدوات لكل 5.
16. مراقبة يوميا لمدة 3 أيام على الأقل بعد الجراحة واستمر في مراقبتها أسبوعيا بعد الجراحة ، وفقا لبروتوكول IACUC.

النتائج

فئة الشكل = 'الصورة image_resized image-style-align-center' style='display:table;margin-left;auto;margin-right:auto;width:75٪;'>

الشكل 1: تحديد موقع الحقن وخط الشق. (أ) مع دعم بطن الجرذ بأنبوب مخروطي سعة 50 مل ، يمكن رؤية الحفرتين بين العضلات فوق الحوض بسهولة (الأسهم). (ب) بيد واحدة تمسك الحفر ، استخدم اليد الأخرى للضغط برفق على العمود الفقري وتحسسه والعثور على المسافة الفقرية بين...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات BD intramedic PE tubingBDPolyethylene Tubeing PE50 ، قطر 0.023 بوصةدينار بحريني 427400 (10 أقدام ، Fischer Scientific 22-204008) أو 427401 (100 قدم ، Fischer Scientific 14-170-12P) BD أنبوب PE المسعف BD أنابيب البولي إيثيلين PE10 ، القطر 0.011 بوصةدينار بحريني 427410 (10 أقدام ، فيشر ساينتفيك 14-170-11B) أو 4274011 (100 قدم ، فيشر ساينتفيك 14-170-12B)BD PrecisionGlide إبر ذات استخدام واحد 30 جمدينار بحريني BD 305128 قنية دليلدينار بحريني19 جم × 1 WT (1.1 مم × 25 مم) إبرةBD 305186حقنة هاميلتون 100 ulشركة هاميلتونحقنة 100 ul معقم حبة ساخنةفاين أدوات العلوم المعقم نموذج رقم. FST 250Povidone ScrubPDI S48050SalineBaxterكلوريد الصوديوم 0.9٪ تسريب وريدي BP 50 مل FE1306Gمشرطريشيمكن التخلص منهمشرط رقم 10وسادة تسخين صغيرةK & H نموذج التصنيع رقم 1060سلك ستايلتماكماستر كار1749T14LH-36233780 ستارة منشفة الجراحةDynarex 4410مقص وملقط جراحيFST وخيوط فيشر العلمية Ethicon 4-0 أو 5-0مصدر بديل للمواد مسبقة الصنع والمعقمة لهذا الإجراء قسطرة الجرعات أنظمةالتسريب SAI أنظمة التسريب RIDC-01قنية دليل أنظمة التسريب SAI RIDC-GCAالقسطرة الداخلية أنظمة التسريب SAI أنظمة التسريب RIDC-INCStylet Wire أنظمة التسريب SAI RIDC-STY