توصيل الحمض النووي الريبي داخل الأنف إلى دماغ الفأر باستخدام جهاز تحديد المواقع

الملخص

المصدر: Ullah, I., et.al. جهاز تحديد المواقع لوضع الفئران أثناء توصيل الحمض النووي الريبي داخل الأنف إلى الجهاز العصبي المركزي. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تقنية دقيقة للإدارة داخل الأنف لإيصال مجمعات الببتيد siRNA التي تستهدف الخلايا العصبية إلى دماغ الفأر باستخدام جهاز تحديد المواقع المتخصص. يتم تأمين الفئران المخدرة في وضع الرأس لأسفل وللأمام لتحسين استنشاق الحمض النووي الريبي مع منع تصريف الرئة. يسهل الببتيد المستهدف امتصاص المستقبلات بوساطة الخلايا العصبية ، مما يتيح توصيل siRNA المستهدف وإسكات الجينات في الدماغ.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحديد موضع الماوس

< نمط p = 'الهامش الأيسر: 40 بكسل ؛'>1. تقييم مستوى التخدير عن طريق منعكس الدواسة (قرصة إصبع القدم الثابتة) للحفاظ على المستوى الجراحي.

2. ضع جهاز تحديد المواقع على مسافة وارتفاع مناسبين لتوفير وصول مريح إلى جميع الكواشف المطلوبة.

3. بمجرد تخدير الفئران بشكل صحيح ، ارفع كل فأر برفق من رقبتها بإصبع الإبهام والمؤشر وضعه على الكرسي المخصص.

4. يعد الوضع الصحيح للماوس على الكرسي أمرا مهما جدا في هذه المرحلة. ضع ظهر الماوس بالتوازي مع الدعامة الخلفية للكرسي ، وعند 90 درجة على مقعد الكرسي. ارفع يديك عن الماوس واترك يستلقي بشكل طبيعي في وضع الرأس لأسفل وللأمام ، دون دفع أو ضغط ، كما هو موضح في الشكل 1 ب. تأكد من أن الأطراف الأمامية للفأر توفر دعما طبيعيا أثناء وجود في هذا الوضع المريح ، دون أي إزعاج للفأر.

5. بمجرد وضع الفئران بشكل صحيح، اربط الفئران بحزام الكرسي، وابدأ على الفور التطعيم داخل الأنف.

2. ملاحظة التسليم داخل الأنف (IN

): يصف هذا البروتوكول تسليم IN لمجمعات RVG9R: siRNA باستخدام جهاز تحديد موضع الماوس. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن إعطاء 20-30 ميكرولتر كحد أقصى من المحلول بسهولة لكل فأر في قطرات 2 ميكرولتر. هذا الحجم أقل من حجم تجويف أنف الفأر ، وهو 0.032 سم³ ، لذلك لا يؤدي الإجراء إلى انسداد الأنف المميت أو الاختناق. يسمح هذا البروتوكول بالتلقيح المتزامن لأربعة فئران على الأقل وثمانية فئران كحد أقصى لكل جهاز ، مما يؤدي إلى تحسين الوقت وتقليل التباين.

1. خذ الماصة الدقيقة سعة 10 ميكرولتر واضبطها على 2 ميكرولتر.

2. قم بتحميل الماصة الدقيقة ب 2 ميكرولتر من محلول RVG9R:siRNA المركب (على سبيل المثال، 5.2 ميكروغرام من siCy5 مركب مع 104 ميكروغرام من RVG9R لتجربة التسليم، و 13.5 ميكروغرام من siSOD1 مركب مع 270 ميكروغرام من RVG9R لتجربة إسكات الصوت، في حجم نهائي قدره 25 ميكرولتر من PBS يحتوي على 5٪ جلوكوز.

3. أثناء الإمساك بالماصة في اليد المهيمنة، اضبط الموضع عن طريق وضع الكوع على الجزء العلوي من المقعد. ادعم اليد التي تمسك الماصة باليد الأخرى لتجنب الحركات غير المنضبطة أثناء الإدارة.

4. ضع قطرة ~ 2 ميكرولتر بالقرب من فتحة أنف واحدة حتى يتمكن الماوس من استنشاق القطرة مباشرة (راجع الشكل 1 ب). إذا لم يتم تشكيل قطرة صغيرة بسهولة ، فاستبدل طرف الماصة بآخر جديد وكرر العملية. استخدم ساعة الإيقاف للتحقق من الفاصل الزمني بين التطعيمات.

5. يسمح هذا الجهاز بعلاج أربعة فئران على الأقل في المرة الواحدة. إذا كانت هناك حاجة إلى مجموعة أخرى من الفئران لتكرار الخطوة 2.4 ، فقم بتعيين شريط آخر بأربعة كراسي أعلى أو أسفل الشريط الأول مع أربعة كراسي لاستيعاب ما يصل إلى ثمانية فئران في المرة الواحدة على الجهاز.

6. كرر الخطوة 2.4 مع فتحة الأنف الأخرى بعد 3-4 دقائق من التلقيح الأول. هذا الفاصل الزمني كاف للفأر لإكمال استنشاق الجرعة الأولى واستعادة التنفس الطبيعي. إذا تم إزاحة قطرة من المحلول المستنشق بسبب الشخير العرضي من ناريس الفأر ، فأعد تلقيح 2 ميكرولتر إضافي من المحلول.

7. كرر العملية برمتها مع فتحات الأنف البديلة حتى تنتهي الجرعة 20-30 ميكرولتر. سوف يستغرق الأمر ~ 30-45 دقيقة لإكمال إجراء التلقيح بالكامل.

8. ضع مرهما مبللا على عيون الفئران قبل إعادة الفئران إلى أقفاصها المخصصة.
ملاحظة: لا تترك الفئران دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image-style-align-center image_resized' style='display: table؛ margin-left: auto ؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: عرض فوتوغرافي لإجراء التلقيح IN باستخدام جهاز تحديد المواقع. (أ) المعدات التجريبية اللازمة للتلقيح الداخلي. (ب) في وضع الرأس لأسفل وللأمام جالسة على الجهاز (يسار) وترسب قطرة 2 ميكرولتر للتلقيح IN (يمين).

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Mouse Cell Balb / cOrient BioN / A6-8 أسابيع من العمر ، 20-30 جرامالببتيدات RVG9RPeptronN / AYTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRRRVM9RPeptronN / AMNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRRRRالبرامج والخوارزميات والأجهزة جهاز تحديد المواقع بالماوسSignet BiotechN / A قليل النوكليوتيدات والبادئات siSOD1ST فارمN / Aالإحساس: 5'- GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'SOD1 بادئاتST فارمN / AF: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'