التصوير في الجسم الحي لاستجابات الخلايا العصبية العقدية الركنية باستخدام الفحص المجهري epifluorescent

الملخص

المصدر: Fowler، B. E.، et al. في الجسم الحي تصوير الكالسيوم لاستجابات الخلايا العصبية العقدية الربطية للفأر لمحفزات التذوق. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لتوصيل الطعم إلى العقدة الركبية المكشوفة جراحيا في فأر مخدر واستخدام مضان GCaMP مع الفحص المجهري الليبي فلورسنت لتصور الاستجابات العصبية في الوقت الفعلي ، مما يساعد في الدراسات حول معالجة إشارات التذوق المحيطي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. قم بتشغيل لوحة tastant
   1. استخدم الشفط لإزالة السائل من فوق الركبة. اختياريا ضع نقطة ماصة للمساعدة في تخفيف التسرب والمساعدة في التنقل المجهري.
   2. ضع على وسادة ماصة تحت المجهر. حدد موقع العقدة الربطية: تشمل المعالم المفيدة الثقب المتبقي في الفقاعة ، والثقب الموجود في العظم الصدغي ، والعصب السابع. باستخدام مرشح FITC / GFP (Fluorescein Isothiocyanate / Green fluorescent protein) على نطاق epifluorescence ، تحقق من وجود الخلايا العصبية العقدية الركبية التي تعبر عن GCaMP. سيوفر هدف 10x (مسافة عمل 10 مم) دقة كافية لتتبع نشاط الخلايا الفردية ، ولكن يمكن أيضا استخدام هدف 20x (مسافة عمل 12 مم).
   3. ضع إبرة الاستغناء عن خط الطعم بإحكام في فم. ضع طبق بتري أسفل فم لالتقاط السوائل.
   4. تأكد من أن الكاميرا تشاهد مجال رؤية المجهر. قم بمزامنة بداية تسجيل الفيديو مع بداية العرض التقديمي.
   5. أثناء التسجيل ، شاهد البث المباشر للردود والانجراف والتسرب.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1ml حقنة مع قفل لورفيشر Scientific14-823-30 27 مقياس حاد الاستغناء عن إبرةفيشر العلميةNC1372532 نقاط الامتصاصفيشر Scientific50-930-668 Acesulfame KFisher ScientificA149025G BD الصواني المسببة للحساسية مع إبرة متصلة بشكل دائمفيشر Scientific14-829-6D حادة الضواعدFST18200-09 اللوحThor LabsMB8 حامل آخر الرأس المخصصeMachineShop انظر الملف المرفق 202410.emsمخصص رأس معدني آخرeMachineShop انظر الملف المرفق 202406.emsوحدة التحكم في درجة الحرارة DCFHC40-90-8D الكاميرا الرقمية ، sCMOS OrcaFlash4 مجهر مثبتHamamatsuC13440 نطاق التقسيمLeicaM80 LED مصدر الضوء البارد LeicaMcrosystemsKL300LED قفل لور 1/16 "محولات الأنابيبفيشر01-000-116 مجهرأوليمبوسBX51WI سلسلة مصغرة من المشاركات البصريةThorlabsMS2R أطباق بتريفيشر العلميFB0875713A الهواء المضغوطAirgas الذكاء الاصطناعي Z300 الملصقات الذاتية شريطفيشر العلمي159015R سيليكون قرصة صمام أنابيب 1/32 بوصة × 1/16 بوصة OD (لكل قدم) أتمتة Scientific05-14 Snap25-2A-GCaMP6s-DJAX25111 مقص الطالبالدقيق أدوات العلومالدقيقة 91460-11 المسبار الجراحيRoboz الجراحيةRS-6067 حامل المسبار الجراحيRoboz Surgical StoreRS-6061 BD Intramedic TubingFisher Scientific22-046941 منظم غاز على مرحلتينAirgasY12FM244B580-AG Tygon أنابيب الفينيل - 1/16 "أتمتة Scientific05-11 Valvelink8.2 وحدة تحكم رقمية / يدويةأتمتة Scientific01-18 Valvelink8.2 قرص صمام التروية نظامأتمتة Scientific17-pp-54 XylazineAnasedNADA # 139-236