تصوير إطلاق الناقل العصبي باستخدام المراسلين الفلوريين المعتمدين على الناقل العصبي القائم على الخلية

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. زرع CNiFER في قشرة الفأر

1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف قبل الجراحة. قم بإعداد حقل شبه معقم للجراحة عن طريق المسح باستخدام 70٪ من الإيثانول ووضع حفاضات مختبر نظيفة.
2. قم بإعداد ماصة حقن CNiFER عن طريق سحب شعرية زجاجية (قطر داخلي يبلغ 0.53 مم) على مجتذب قطب كهربائي عمودي. استخدم زوجا من ملقط الرأس الدقيق رقم 5 لكسر طرف القطب الكهربائي إلى قطر ~ 40 ميكرومتر.
   ملاحظة: من الأفضل تحقيق ذلك تحت مجهر تكبير استريو مع graticule.
3. تخدير فأر C57BL / 6 مع الأيزوفلوران (يوم ما بعد الولادة 60-90) : 4٪ (حجم / حجم) للتحريض و 1.5 إلى 2.0٪ (حجم / حجم) للصيانة. استخدم قرصة الذيل أو إصبع القدم للتأكد من أن الفأر مخدر بالكامل.
   ملاحظة: أعد الضغط بشكل دوري وقم بتقييم ارتعاش الشعيرات أثناء الجراحة لإعادة تقييم عمق التخدير.
4. غطي العينين بمرهم للعيون لمنع الجفاف. قم بتركيب الماوس في إطار تجسيمي مع قضبان أذن. حافظ على درجة حرارة جسم الفأر عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة حرارية ينظمها مسبار المستقيم.
5. احلق مساحة 5 مم × 12 مم تقريبا باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية للحيوانات. ضع البيتادين متبوعا بنسبة 70٪ (حجم / حجم) إيزوبروبانول. استخدم شفرة مشرط لقص وإزالة الجلد من سطح الجمجمة. استخدم شفرة مشرط لإزالة السمحاق من سطح الجمجمة. كشف وتنظيف سطح الجمجمة ، كما هو موضح للجراحة التجسيمية.
6. اخفض ماصة زجاجية فارغة إلى بريجما وسجل الإحداثيات الأمامية الخلفية (A / P) والمتوسطة الجانبية (M / L). بالإشارة إلى أطلس دماغ الفأر ، احسب موضع موقع الحقن. قم بتحويل الماصة إلى الموقع المستهدف وقم بتمييز الجمجمة لتكوين النافذة لاحقا.
   ملاحظة: يعتمد موقع الحقن والنافذة على المنطقة المراد دراستها وتوزيع الناقل العصبي أو النتوءات التي تطلق الببتيد في القشرة. على سبيل المثال ، في منشور حديث ، تم استخدام الإحداثيات التجسيمية +1.0 إلى +2.0 مم A / P و +1.0 إلى +2.0 مم M / L لحقن خلايا CNiFER في القشرة الأمامية للتصوير في الجسم الحي لإفراز الدوبامين أثناء التكييف الكلاسيكي.
7. قم بتشكيل نافذة جمجمة رقيقة مقاس 2 مم × 3 مم.
   ملاحظة: يجب أن يكون سمك العظم في النافذة 15-20 ميكرومتر. يجب ألا تكون البقع البيضاء الصغيرة في العظم مرئية عند ترطيب سطح الجمجمة ، إذا كان العظم رقيقا بدرجة كافية.
8. ضع إسفنجة مبللة بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) على النافذة للحفاظ على رطوبتها أثناء تحضير الخلايا للحقن.
9. احصد استنساخ CNiFER الذي نمت في قارورة T75 إلى ~ 80٪ من التقاء. استنشق الوسائط واغسل الخلايا بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS). ملاحظة: تم حذف التربسين لهذه الخطوات.
10. قم بإزالة PBS واستخدم 10 مل من ACSF لإخراج الخلايا من قاع القارورة. ثلاثي الخلايا لفصل كتل الخلايا. جهاز طرد مركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من ACSF. جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية عند 1,400 × جم وإزالة المادة الطافية ، وترك حبيبات مغطاة ب ACSF. تترك هذه الخطوة مجموعة من الخلايا معلقة.
11. قم بإعادة ملء ماصة الحقن المحضرة في الخطوة 1.2 بالزيت المعدني، وقم بتحميل الماصة على حاقن نانوي، وقم بدفع المكبس لإخراج حبة صغيرة من الزيت. ضع 5 ميكرولتر من تعليق خلية CNiFER على شريط من فيلم البارافين البلاستيكي بالقرب من مستحضر الماوس. ارسم إما CNiFERs أو تحكم في خلايا CNiFER في الماصة المسحوبة.
12. حرك الماصة إلى إحداثيات X وY المستهدفة، أي A/P وM/L المشار إليهما في الخطوة 1.5. اخفض الماصة ، واثقب الجمجمة الرقيقة ، واستمر في ~ 200-400 ميكرومتر تحت سطح الجمجمة ، لإيداع خلايا CNiFER في طبقات 2/3 من القشرة.
13. قم بحقن ~ 4.6 nl من خلايا CNiFER في أعمق موقع باستخدام الحاقن النانوي ، ولاحظ الحركة في واجهة الزيت والخلية ثم انتظر لمدة 5 دقائق حتى يتم توزيع الخلايا. اسحب الماصة ~ 100 ميكرومتر وقم بحقن ~ 4.6 ميكرومتر آخر من خلايا CNiFER ، وانتظر 5 دقائق. ثم اسحب الماصة ببطء ورفق لمنع التدفق العكسي ل CNiFERs. كرر الحقن في موقع واحد أو أكثر من المواقع المجاورة.
14. كرر خطوات الحقن 1.8-1.12 مع خلايا التحكم HEK293 (على سبيل المثال ، استنساخ HEK293 / TN-XXL / Gqi5 يفتقر إلى المستقبلات المقترنة ببروتين G [GPCR]). افصل CNiFER وتحكم في مواقع حقن الخلايا بمقدار ~ 200 ميكرومتر.
15. بعد الانتهاء من زراعة الخلايا ، اشطف نافذة الجمجمة الرقيقة باستخدام ACSF وانتظر حتى تجف الجمجمة. ضع قطرة من غراء سيانواكريليت (انظر المواد) على النافذة وضع زجاج غطاء معقم مقطوع مسبقا بسرعة فوق الغراء. ادفع زجاج الغطاء برفق على الجمجمة لبضع ثوان. دع الغراء يجف لمدة 2 دقيقة.
16. أغلق حواف زجاج الغطاء بأسمنت الأسنان وشكل حفرة حول النافذة للاحتفاظ بالماء لهدف الغمس.
17. لتثبيت رأس الماوس أثناء التصوير ، قم بتوصيل قضيب رأس مصمم خصيصا بقطرة صغيرة من غراء السيانوا أكريليت خلف النافذة. دع الغراء يجف جيدا ثم أضف أسمنت أسنان إضافيا لتعزيز قضيب الرأس المصمم خصيصا.
18. قم بتغطية باقي سطح الجمجمة ، باستثناء النافذة ، بطبقة من الأسمنت الأسنان. تأكد من تغطية حواف الجلد بالأسمنت واتركها تجف لمدة 20 دقيقة.
19. بعد الجراحة، توقف عن إعطاء الأيزوفلوران واترك الفأر على وسادة تدفئة في قفص حتى يتعافى تماما من التخدير. حقن 5٪ (وزن / حجم) الجلوكوز في محلول ملحي (تحت الجلد [s.c.]) للإماهة و 0.05 إلى 0.1 مجم / كجم بوبرينورفين (داخل الصفاق [IP] ، الإطلاق الفوري) للمسكنات بعد الجراحة.
    ملاحظة: لتقليل التفاعل المناعي المحتمل ل CNiFERS البشرية ، قم بحقن الفأر يوميا ب 20 ميكرولتر / 100 جم من السيكلوسبورين (IP) بدءا من اليوم السابق لحقن CNiFERs.
20. أعد الفأر إلى قفص منزله للحصول على الطعام والماء.

2. التصوير في الجسم الحي لاستنساخ CNiFER

ملاحظة: يتم إجراء التصوير الحي بالفئران باستخدام مجهر ثنائي الفوتون وجهاز مثبت بالرأس. لا حاجة للتخدير أثناء جلسات التصوير. عند تصوير في حالة اليقظة ، قلل من ضبط النفس إلى بضع ساعات فقط في كل مرة لتقليل مستويات التوتر. أعد إلى قفص المنزل بين جلسات التصوير للطعام والماء. يتم تقليل الضغط المحتمل عن طريق تعتيم أضواء الغرفة والجزء المحيط بالماوس في العلبة.

1. في اليوم التالي للجراحة ، قم بتركيب الماوس على منصة تصوير عن طريق شد قضيب الرأس المعدني المزروع على الجمجمة في إطار تثبيت الرأس.
   ملاحظة: عند تصوير الفئران المستيقظة ، يجب ألا تتجاوز جلسة التصوير بضع ساعات بسبب الضغط المحتمل الناجم عن جهاز تثبيت الرأس.
2. ضع منصة التصوير مع الماوس المقيد بالرأس في مجهر تصوير ثنائي الفوتون مزود بأهداف الغمر في الماء 10X (0.30 NA) و 40X (0.80 NA).
3. أدخل مكعب مرشح لتصوير نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) (بروتين الفلورسنت السماوي المحسن [eCFP] والسترين) الذي يحتوي على مرآة ثنائية اللون عند 505 نانومتر ومرشحات تمرير النطاق التي تمتد من 460 نانومتر إلى 500 نانومتر لقياس eCFP و 520 نانومتر إلى 560 نانومتر لقياس السترين.
4. أضف ACSF إلى البئر الذي يحتوي على نافذة جمجمة رقيقة وقم بخفض هدف الغمر في الماء في ACSF. استخدم العدسة مع مصباح الزئبق ومكعب مرشح البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتحديد سطح القشرة والأوعية الدموية أسفل النافذة.
   ملاحظة: يساعد نمط الأوعية الدموية في تحديد موقع نفس المنطقة وتصويرها على مدار أيام التصوير المتكررة. قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء 40X لتحديد موقع CNiFERs عن طريق التركيز يدويا على سطح القشرة فوق الخلايا باستخدام مكعب مرشح GFP ومصباح الزئبق.
5. إعداد للتصوير ثنائي الفوتون. حدد مسار الضوء المناسب للتصوير ثنائي الفوتون. بالنسبة لنظام تجاري نموذجي ، استخدم البرنامج للتبديل إلى وضع التصوير ثنائي الفوتون وإعادة توجيه الضوء إلى أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs) في أجهزة الكشف غير الممسوحة ضوئيا. قم بتشغيل الليزر النبضي للفيمتو ثانية القريبة من الأشعة تحت الحمراء ، وحدد الطول الموجي 820 نانومتر وإعداد الطاقة من 5-15٪.
   ملاحظة: توفر طاقة 5٪ عادة ~ 25 ميجاوات في العينة.
6. اضبط جهد PMT1 و PMT2 بالقرب من القيمة القصوى ، عادة 700-1,000 فولت اعتمادا على PMT. اضبط الكسب على 1 لكل قناة وصفر الموضع z للهدف.
7. اخفض الهدف ~ 100 إلى 200 ميكرومتر من السطح القشري وابدأ المسح الضوئي xy. اضبط طاقة الليزر ، والكسب ، وجهد PMT لكل قناة ، أي eCFP و Citrine ، لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء لمضان CNiFER.
8. استخدم ميزة التكبير/التصغير في البرنامج لتقييد الصورة بمنطقة تحتوي على خلايا CNiFER بالإضافة إلى منطقة الخلفية. استخدم معدل مسح ضوئي لا يزيد عن إطار واحد كل 2 ثانية (0.5 هرتز) بمعدل 4 ميكرو ثانية لكل بكسل. اضبط متوسط الخط لنسبة الإشارة إلى الضوضاء المناسبة ، على سبيل المثال ، متوسط كالمان 2 خط.
9. ارسم منطقة الاهتمام (ROI) حول خلايا CNiFER ، تحيط بحوالي 3 إلى 4 خلايا لكل مستوى. قم بإعداد تحليل في الوقت الفعلي لمتوسط شدة عائد الاستثمار. ابدأ الاستحواذ لمراقبة مضان CNiFER بمرور الوقت.
10. اجمع التألق من CNiFERs قبل وأثناء التلاعب التجريبي ، على سبيل المثال ، التحفيز الكهربائي ، تحفيز Channelrhodopsin-2 (ChR2) ، السلوك ، على النحو الذي يحدده المستخدم.
11. عند اكتمال تجربة التصوير، أعد الفأر إلى قفصه المنزلي. كرر التصوير على مدار أيام ، حسب الرغبة. عند إعادة التصوير ، تشير الخلايا إلى صورة الأوعية الدموية منخفضة التكبير المكتسبة مسبقا للعودة إلى نفس مجال التصوير (الخطوة 2.4).
    ملاحظة: يمكن تصوير CNiFERs المزروعة لمدة 7 أيام على الأقل.