عزل وتنقية البروتينات السكرية قليلة التغصن المؤتلفة

الملخص

المصدر: Jain، R. W.، et al. إنتاج وتنقية بسيط وفعال للبروتين السكري من المايلين قليل التغصن للفأر للدراسات التجريبية لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو عزل وتنقية MOGtag ، وهو بروتين سكري مؤتلف من المايلين قليل التغصن (MOG) يستخدم في الدراسات التجريبية لالتهاب الدماغ والوقاية المناعي الذاتي (EAE). يتضمن البروتوكول التحلل البكتيري ، والصوتنة ، والطرد المركزي ، وكروماتوغرافيا تقارب النيكل للحصول على MOGtag منقى. يتيح هذا البروتين أبحاث المناعة الذاتية بوساطة الخلايا البائية في نماذج التصلب المتعدد.

البروتوكول

1. حصاد بروتين MOGtag

ملاحظة: في هذه المرحلة ، ستكون البكتيريا قد أنتجت كميات كبيرة من بروتين MOGtag. لحصاد MOGtag ، يتم تحلل البكتيريا أولا في مخزن مؤقت Triton X-100 ، يليه صوتنة. ثم يتم إطلاق MOGtag من الأجسام المشمولة وتشويهها باستخدام الإيميدازول والجوانيدين ، مما ينتج عنه محلول بروتيني خام يحتوي على بروتين MOGtag.

1. خذ حبة واحدة سعة 1 مل من إحدى المزارع الليلية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. حبيبات الخلايا عند 16,000 × جم لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة الطافية. قم بتسمية الأنبوب إلى / N (بعد الحث) ، ثم ضع الحبيبات البكتيرية في فريزر -20 درجة مئوية لتحليل صفحة SDS في المستقبل (الشكل 2).
2. وزع المزارع بالتساوي على زجاجات سعة 250 مل متوافقة مع أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة واحتفظ بها على الجليد من هذه النقطة فصاعدا. حبيبات الخلايا البكتيرية عند 22,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
3. تخلص من المادة الطافية. قم بتخزين الكريات البكتيرية عند -20 درجة مئوية أو تابع الخطوة 1.4.
4. تحضير المخزن المؤقت للتحلل (0.1 مجم / مل ليزوزيم بيض الدجاجة ، 0.1٪ تريتون-إكس (v / v) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)) عن طريق إضافة 60 ميكرولتر من Triton X-100 و 120 ميكرولتر من محلول مخزون ليزوزيم بيض الدجاجة 50 مجم / مل إلى 60 مل من PBS.
5. قم بتعليق ودمج جميع الكريات البكتيرية من الخطوة 1.3 بإجمالي 30 مل من محلول التحلل. انقل هذا الحجم إلى أنبوب دائري القاع سعة 50 مل قادر على الطرد المركزي عالي السرعة. ضع هذا الأنبوب في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال وقت الحضانة ، رج الأنبوب مرتين لإعادة تعليق الخلايا.
6. بعد الحضانة ، انقل الأنبوب إلى الجليد وقم بصوتنة المحلول عند 20 كيلو هرتز ، والسعة 70٪ ، والنبض لمدة 3 ثوان ، والنبض لمدة 3 ثوان ، وخمس نبضات في كل جولة. قم بتسخين المحلول لمدة ست جولات إجمالية واترك المحلول يبرد على الجليد بين الجولات.
7. قم بالطرد المركزي للمحلول عند 24,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وكرر الخطوات 1.5-1.7 مرة واحدة. قم بتخزين الحبيبات عند -20 درجة مئوية أو تابع الخطوة 1.8.
8. تحضير المخزن المؤقت A (500 ملي كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، 20 ملي مولار Tris-HCl (تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد) ، 5 ملي مولار إيميدازول ، درجة الحموضة 7.9) بإضافة 0.8766 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.09456 جم من Tris-HCl ، و 0.01021 جم من إيميدازول إلى دورق 100 مل. أضف الماء حتى يصل الحجم إلى 28 مل ، ثم اضبط درجة الحموضة في المحلول على 7.9. ثم انقل المحلول إلى أسطوانة متدرجة سعة 100 مل وأضف الماء حتى يصبح الحجم 30 مل.
9. أعد تعليق الحبيبات من الخطوة 1.7 في 30 مل من المخزن المؤقت A واحتضان هذا المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات. خلال هذا الوقت ، قم بوزن 17.2 جم من جوانيدين حمض الهيدروكلوريد.
10. قم بتقطيع المحلول على الجليد باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوة 1.6. ثم أضف 17.2 جم من جوانيدين حمض الهيدروكلوريك إلى المحلول. احتضان هذا على الجليد لمدة 1 ساعة لإذابة بروتين MOGtag.
قم
11. بالطرد المركزي للمحلول عند 24,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية وقم بتخزين المادة الطافية عند 4 درجات مئوية حتى تنقية البروتين.

2. تنقية البروتين

ملاحظة: في الخطوات التالية ، سيتم تنقية بروتين MOGtag من خلال 4 جولات من الامتصاص على راتنج النيكل المشحون (عبر علامة His-tag) والشطف.

1. قم بعمل المخازن المؤقتة التالية:
   1. قم بإعداد المخزن المؤقت B (500 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، 5 ملي إيميدازول ، 6 م جوانيدين حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.9). أضف 5.844 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.6304 جم من Tris-HCl ، و 0.0681 جم من إيميدازول ، و 114.64 جم من جوانيدين حمض الهيدروكلوريك إلى دورق سعة 500 مل. ثم أضف الماء حتى يصل إلى 190 مل واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.9. انقل المحلول إلى أسطوانة متدرجة سعة 250 مل وأضف الماء حتى يصبح الحجم 200 مل.
   2. تحضير المخزن المؤقت Elution (500 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي Tris-HCl ، 0.5 م إيميدازول ، 6 م جوانيدين حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.9). أضف 5.844 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.6304 جم من Tris-HCl ، و 6.808 جم من إيميدازول ، و 114.64 جم من جوانيدين حمض الهيدروكلوريك إلى دورق سعة 500 مل. أضف الماء حتى يصل إلى 190 مل واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.9. انقل المحلول إلى أسطوانة متدرجة سعة 250 مل وأضف الماء حتى يصبح الحجم 200 مل.
   3. تحضير المخزن المؤقت الشريطي (500 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي Tris-HCl ، 100 ملي EDTA (حمض رباعي الأسيتيك ثنائي الإيثيلين) ، الرقم الهيدروجيني 7.9). أضف 5.844 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.6304 جم من Tris-HCl ، 40 مل 500 ملي EDTA إلى دورق سعة 500 مل. أضف الماء حتى يصل إلى 190 مل واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.9. انقل المحلول إلى أسطوانة متدرجة سعة 250 مل وأضف الماء حتى يصبح الحجم 200 مل.
   4. تحضير المخزن المؤقت للشحنة (0.1 متر كبريتات النيكل). أضف 5.257 جم من كبريتات النيكل إلى دورق سعة 500 مل وأضف الماء حتى يصل إلى 190 مل (تحذير ، لا تتعامل مع كبريتات النيكل خارج غطاء الدخان حتى تذوب كبريتات النيكل في الماء). بمجرد ذوبان كبريتات النيكل ، انقل المحلول إلى أسطوانة متدرجة سعة 250 مل وأضف الماء حتى يصل الحجم إلى 200 مل.
2. قم بتقسيم 10 مل من راتنج النيكل بين أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل قادرين على تحمل قوى الطرد المركزي التي تزيد عن 4,500 × جم (5 مل في كل أنبوب).
3. شحن راتنج النيكل وموازنته:
   1. اغسل الراتنج بإضافة 40 مل من الماء إلى كل أنبوب يحتوي على الراتنج. ضع الأنابيب أفقيا على كرسي هزاز واتركها تتحرك لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بمجرد الانتهاء ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 4,500 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   2. تخلص من المادة الطافية عن طريق سحب العينة لتجنب إزعاج الحبيبات. أضف 40 مل من مخزن الشحن إلى كل أنبوب. انقل الأنابيب إلى كرسي هزاز واتركها تتحرك لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بمجرد الانتهاء ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 4,500 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   3. تخلص من المادة الطافية ، ثم أضف 40 مل من المخزن المؤقت B إلى الأنابيب. انقل الأنابيب إلى كرسي هزاز واتركها تتحرك لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بمجرد الانتهاء ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 4,500 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من المواد الطافية الطافية
4. اختياري: خذ 150 ميكرولتر من البروتين المذاب الذي تم جمعه في الخطوة 1.11 وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قم بتسمية الأنبوب على أنه حضانة مسبقة وقم بتجميده عند -20 درجة مئوية لتحليل صفحة SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم) في المستقبل (الشكل 2 ، علامة MOGtag الخام).
5. تنقية بروتين MOGtag:
   1. انقل الحجم الكامل للبروتين المذاب من الخطوة 1.11 (~ 40 مل ، مطروحا منه العينة الصغيرة التي تمت إزالتها في الخطوة 2.4) إلى الأنبوب الأول (الشكل 1 ، الأنبوب 1) الذي يحتوي على راتنج النيكل من الخطوة 2.3 ، واخلطه ، وضعه أفقيا على كرسي هزاز عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
   2. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 4,500 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. بمجرد الانتهاء ، انقل المادة الطافية إلى الأنبوب الثاني (الشكل 1 ، الأنبوب 2) من راتنج النيكل واحتضانها كما هو موضح في الخطوة السابقة. في غضون ذلك ، تابع الخطوات من 3 إلى 6 أدناه باستخدام الأنبوب 1.
   3. أعد تعليق راتنج النيكل في الأنبوب 1 في 40 مل من المخزن المؤقت للشطف وضع الأنبوب أفقيا على الروك عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 4,500 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   4. انقل المادة الطافية التي تحتوي على بروتين MOGtag المملوء إلى زجاجة سعة 250 مل تحمل علامة "بروتين MOGtag المنقى" واحتفظ بهذه الزجاجة عند 4 درجات مئوية. مع كل خطوة شطف ، قم بتجميع المادة الطافية الناتجة في هذه الزجاجة.
   5. أضف 40 مل من المخزن المؤقت الشريطي إلى راتنج النيكل وضعه أفقيا على الروك لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   قم
   6. بالطرد المركزي للأنبوب عند 4,500 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   7. بمجرد الانتهاء ، تحرك للأمام باستخدام الأنبوب الثاني كما هو موضح في الخطوة 2.5. ما مجموعه 4 جولات من امتصاص البروتين المذاب من الخطوة 1.11 على راتنج النيكل المشحون والشطف سيستعيد معظم البروتين على الرغم من أنه ، إذا رغبت في ذلك ، يمكن استرداد بروتين إضافي في جولات إضافية من الامتصاص والشطف.
6. بمجرد اكتمال أربع جولات (أو أكثر) من الامتصاص والشطف، قم بتخزين البروتين المنقى المجمع عند 4 درجات مئوية طوال الليل. يمكن تخزين راتنج النيكل في 40 مل من محلول الإيثانول بنسبة 20٪ عند 4 درجات مئوية حتى يتم الحاجة إليه مرة أخرى.

النتائج

فئة الشكل = 'image image-style-align-center image_resized' style='display: table؛ margin-left: auto ؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: نظرة عامة على الخطوات المطلوبة لإنتاج بروتين MOGtag النقي. لتوليد بروتين MOGtag ، تزرع البكتيريا التي تعبر عن بروتين MOGtag إلى كثافة عالية ثم يتم حثها على التعبير عن MOGtag باستخدام IPTG كما هو مذكور في ...

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات BL21 E.coli- pet32-MOGtagKerfoot lab هذه البكتيريا مطلوبة لصنع بروتين MOGtag. مخزون الجلسرين من هذه البكتيريا متوفرة عند الطلب.LB مرق ميلرBioshopLBL407.1 AmpicillinBio basicAB0028أعد تركيب المسحوق إلى 50٪ إيثانول / 50٪ H₂O عند 100 مجم / مل. يحفظ في -20 درجة مئوية.IPTGBioshopIPT002.5أعد تركيب المسحوق في H₂O عند 1 متر وتخزينه عند -20 درجة مئوية.يعاد تكوين ليزوزيم الدجاج والبيضLYS702.10في H₂O عند 50 مجم / مل ويخزن في -80 درجة مئوية.Triton-X100SigmaT-8532 تقنيات الحياة المملحية المخزنة بالفوسفات20012-027المحلول الملحي المخزن بالفوسفات التجاري غير مطلوب ، وأي محلول ملحي مخزن بالفوسفات القياسي المصنوع في المختبر كاف.كلوريد الصوديومBioshopSOD004.1 Tris-HClBioshopTRS002.1 ImidazoleBioshopIMD508.100 Guanidine-HClSigmaG3272يجب أن تكون الجودة أكبر من 98٪ نقاء.0.5M EDTAbioshopEDT111.500 كبريتات النيكل (II)BioshopNIC700.500 راتنج ربطEMD Millipore69670-3يخزن في 20٪ إيثانول 80٪ H₂O عند 4 درجات مئويةالكحوليات التجارية للإيثانول اللامائيP016EAANتخفيفها بالماء حسب الحاجة.حمض الخليك الجليديBioshopACE222.1 أسيتات الصوديوم ثلاثي هيدراتBioshopSAA305.500 ألبومين مصل البقرالقياسي الحيوي500-0206 حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين ديامين ، ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديومفيشر العلميBP120-500 البولي إيثيلين جلايكول 3350BioshopPEG335.1 بولي إيثيلين جلايكول 8000بيوشوبPEG800.1 سونيكاتورفيشر العلميFB-120-110 كبريتات دوديسيل الصوديومBioshopSDS001