تنظيم نمو خلايا شوان في المختبر باستخدام تقنية المجال الكهربائي النبضي النانو ثانية

الملخص

المصدر: Han، J.، et.al. تنظيم نمو خلايا شوان عن طريق المجال الكهربائي النبضي النانو ثانية لتجديد الأعصاب الطرفية في المختبر. J. Vis. Exp. (2024)

يوضح هذا الفيديو تطبيق تقنية المجال الكهربائي النبضي النانو ثانية (nsPEF) لتعديل نمو خلية شوان (SC). تحفز النبضات الكهربائية السريعة المسام النانوية العابرة في أغشية SC ، مما يسهل تدفق الكالسيوم الذي ينشط مسارات الإشارات التي تؤدي إلى انتشار SC ، وعدم التمايز ، وإفراز عامل التغذية العصبية. تعزز هذه الاستجابات الخلوية الدعم المحوري ، وبقاء الخلايا العصبية ، وتكوين النخاع المحتمل ، مما يسلط الضوء على nsPEF كأداة واعدة لإصلاح الأعصاب.

البروتوكول

1. إذابة خلايا RSC96 المحفوظة بالتبريد

1. قم بإذابة الجليد الذي يحتوي على 1 مل من معلق الخلية عن طريق رجها بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية ثم إضافتها إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 4-6 مل من وسط الاستزراع الكامل واخلطها جيدا.
2. جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 3-5 دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط الثقافة الكامل.
3. أضف معلق الخلية إلى قارورة (أو طبق) تحتوي على 6-8 مل من وسط الثقافة الكامل واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
4. في اليوم التالي ، راقب نمو الخلايا وكثافتها تحت المجهر.

2. مرور الخلية:

ملاحظة: إذا وصلت كثافة الخلية إلى 80٪ -90٪ ، فهي جاهزة للمرور.

1. تخلص من وسط المزرعة واشطف الخلايا 1-2 مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم.
2. أضف 0.25٪ (وزن / حجم) التربسين -0.53 ملي مولار EDTA إلى قارورة الاستزراع (1-2 مل لقارورة T25 ، 2-3 مل لقارورة T75) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة.
3. راقب انفصال الخلية تحت المجهر. إذا أصبحت معظم الخلايا مستديرة وانفصلت ، فأعد القارورة بسرعة إلى منطقة العمل ، واضغط على القارورة برفق ، وأضف 3-4 مل من وسط الثقافة الذي يحتوي على 10٪ FBS لوقف الهضم.
4. امزج المحتويات ، واستنشق المحلول ، وجهاز الطرد المركزي على حرارة 1000 × جم لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا عن طريق إضافة 1-2 مل من وسط المزرعة الطازجة وسحب العينة برفق.
5. انقل تعليق الخلية إلى قارورة T25 جديدة بنسبة 1: 2 وأضف 7 مل من وسط الاستزراع.

3. تشغيل جهاز nsPEF

1. قم بإعادة تعليق خلايا RSC96 في 1 مل من وسط ثقافة DMEM ونقلها إلى أطباق قياس الألوان مع أقطاب كهربائية على كلا الجانبين.
2. قم بتشغيل مفتاح الطاقة.
3. اضبط المعلمات عن طريق تدوير المقبض الموجود على الجهاز لتغيير شدة المجال الكهربائي. الشدة المحددة في هذه الدراسة هي 5 كيلو فولت / سم ، 10 كيلو فولت / سم ، 20 كيلو فولت / سم ، و 40 كيلو فولت / سم.
4. قم بتدوير الأقطاب الكهربائية بعناية حتى تظهر الشرر ، مما يسمح للخلايا بتلقي 5 نبضات من nsPEF وفقا لشدة شدة المجال المحددة مسبقا قبل فصل القطبين على الفور.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات High Voltage Power Supply for nsPEFMatsusada Precision Inc.AU-60P1.6-L ماصةووهان كزافييه للتكنولوجيا الحيوية المحدودة RSC96 خلايا شوانووهان كزافييه التكنولوجيا الحيوية المحدودةSTCC30007G-1 Scanister3DHISTECHPannoramic MIDI كابل خاص لأنظمة الميكروويف nsPEFTimesM17 / 78-RG217