حقن ناقل فيروسي في الحبل الشوكي للفئران لتتبع الخلايا العصبية الرجعية

الملخص

المصدر: Keefe، K. M.، et al. يسلط الحقن المباشر لناقل الفيروس العسسي الضوء على مسارات حركية متعددة في الحبل الشوكي للفئران. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو حقن ناقل فيروسي عالي الكفاءة للنقل إلى الوراء (HiRet) في الحبل الشوكي للفئران لتتبع المسارات العصبية. يحتوي الفيروس على بروتينات سكرية للدخول المشبكي وجين ترميز البروتين الفلوري. يتم إدخال الإبرة في الحبل الشوكي ، ويتم إعطاء تعليق الفيروس بمعدل متحكم فيه. يتم سحب الإبرة أخيرا بعد إتاحة الوقت الكافي لانتشار الفيروس.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الاستعدادات قبل الجراحة:

1. قم بإعداد إبر زجاجية مسحوبة للحقن الفيروسي قبل أيام قليلة من الجراحة باستخدام ماصات شعرية زجاجية سعة 3.5 نانولتر مصممة لحاقن النانولتر. اسحب كل ماصة على مجتذب إبرة من خطوتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإنشاء قوالب ذات إبرتين.
2. قم بتنقيح طرف قوالب الإبرة عن طريق قطع ما يقرب من 1-2 مم من الزجاج الزائد بمقص دقيق. قم بقياس حجم الفتحة التقريبي تحت المجهر باستخدام شريحة معايرة المجهر لعزل الإبر ذات الفتحات 30-40 ميكرومتر.
3. مع وضع الإبرة عند 30 درجة، استخدم شطفاف ماصة دقيقة لإنشاء طرف بفتحة 30-40 ميكرومتر وزاوية مشطوفة 45 درجة. تحقق من عرض الفتحة باستخدام مقياس Vernier على شريحة المعايرة. مرر الماء والإيثانول عبر الإبرة الزجاجية باستخدام حقنة ذات ملحق إبرة مرنة لغسل الحطام وتمييز الإبرة على فترات منتظمة بعلامة سوداء.
4. ضع الإبر في طبق بتري مغطى تم تنظيفه مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول وتعقيمه لمدة 30 دقيقة في غطاء السلامة الحيوية تحت الأشعة فوق البنفسجية أو الأشعة فوق البنفسجية.
5. قم بإعداد فيروس عدسي للنقل الرجعي (HiRet) عالي الكفاءة عن طريق إزالة حجم مناسب من المجمد مباشرة قبل الإجراء.
   ملاحظة: يتضمن الحجم المناسب الكمية اللازمة للحقن (1 ميكرولتر لكل حقنة × عدد الحقن) بالإضافة إلى كمية صغيرة من الحجم الإضافي لحساب خسائر سحب العينات والتحميل. نقل الفيروس وتخزينه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
6. قم بإعداد الحاقن عن طريق توصيله بالمضخة الدقيقة ووضعه في معالج دقيق بمقياس Vernier.
7. لتحضير الإبرة الزجاجية ، قم بتحميل صبغة ملونة بعناية مثل الزيت الأحمر بحقنة مزودة بإبرة مرنة. تأكد من عدم وجود فقاعات في الإبرة. استخدم تقنية معقمة عند التعامل مع الإبرة ، وامتنع عن لمس الحافة.
8. أدخل الإبرة الزجاجية في الحاقن ، مع التأكد من تثبيت الإبرة بشكل صحيح في الغسالات ، وغطاء الحاقن مشدود بإحكام ، ويتم تمديد إبرة الحاقن الفولاذية حوالي 3/4 طول الإبرة الزجاجية. يمكن تحميل الفيروسات في الإبرة في خطوة لاحقة.

2. التخدير وإعداد موقع الجراحة

1. : قم بوزن على مقياس رقمي. سجل الوزن قبل الجراحة لتحديد حجم التخدير المطلوب وللسماح بمراقبة الوزن بعد الجراحة. تم استخدام إناث فئران Sprague-Dawley ، حوالي 200-250 جم ، في هذا البروتوكول.
2. تخدير الجرذ إما باستخدام استنشاق الأيزوفلوران أو محلول الكيتامين / الزيلازين المحقون (k / x). هنا ، يتم حقن الكيتامين داخل الصفاق بجرعة 67 مجم / كجم والزيلازين بجرعة 6.7 مجم / كجم.
3. تأكد من وجود مستوى مخدر مناسب عن طريق الضغط على القدم بقوة. في حالة حدوث انسحاب انعكاسي ، انتظر عدة دقائق إضافية قبل المتابعة.
   ملاحظة: لاحظ أيضا الشعيرات والعينين ومعدل التنفس بحثا عن علامات الوعي. إذا كانت الشعيرات ترتعش ، أو تومض العين عند لمسها برفق ، أو كان التنفس سريعا وضحلا ، فانتظر حتى تصبح مستوى التخدير أعمق للمضي قدما في البروتوكول. أيضا ، راقب هذه العلامات طوال عملية استئصال الصفيحة الفقرية وجراحة الحقن. إذا أظهر مستوى مخدر ضحلا ، فقم بإعطاء جرعة معززة من الكيتامين فقط - تساوي 1/2 الجرعة الأصلية k / x.
4. احلق الجرذ على طول خط الوسط الظهري من الوركين إلى الزاوية السفلية لوح الكتف. اسحب جلد مشدودا لحلاقة أسهل وأكثر دقة.
5. ضع مرهم العين على كلتا العينين.
6. ضع مطهر على المنطقة المحلوقة لتعقيم الموقع. للفرك الأول ، انقع الشاش المعقم بمحلول اليود بنسبة 5٪ وامسح كل الشعر والحطام. اتبع ذلك بتمريرة أحادية الاتجاه بشاش معقم مبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول حتى لا يتم الاتصال بأي منطقة مرتين. استخدم نفس التقنية مع الشاش المنقوع باليود والإيثانول بالتناوب مرتين أخريين.

3. الإعداد الجراحي للمجال الجراحي والأدوات

1. قم بإعداد مجموعة من الأدوات الجراحية المعقمة التي تشمل مشرط ، وجرجير ، وملقط أسنان الفئران ، ومقص زنبركي ، ومرقئ ، وملقط منحني متوسط النقطة ، ومباعدات أو خطافات مرجحة عن طريق فك غلاف الغلاف المعقم لإنشاء حقل معقم.
2. افتح عبوة من القفازات الجراحية المعقمة وضع غلاف القفازات المعقم على الطاولة. استخدم هذا كحقل معقم إضافي للأدوات المستخدمة لمنع تلوث الغلاف المعقم.
3. قم بإسقاط شفرة مشرط # 10 على الحقل المعقم. قم بتثبيت الشفرة بمقبض بمرقئ. ضع محلول ملحي معقم ، وخياطة 4.0 كرومي ، ومواد للسيطرة على النزيف مثل الكي ، أو الشاش المعقم ، أو أدوات التطبيق المعقمة ذات الرؤوس القطنية (لنزيف العضلات) ، أو الرغوة أو شمع العظام (لنزيف العظام) في مكان يسهل الوصول إليه.
4. استرجع وضعه على قطعة قماش معقمة. ضع الشاش تحت المثانة لجمع البول. ادعم المنطقة المستهدفة بمنشفة ملفوفة تحت البطن. إذا كان ذلك متاحا ، ضع وسادة تدفئة جراحية أسفل قطعة القماش المعقمة ، خاصة للإجراءات الطويلة.
   ملاحظة: العقم مهم أثناء جراحة البقاء على قيد الحياة. احتفظ بزجاجة رذاذ تحتوي على 70٪ من الإيثانول في متناول اليد للحفاظ على عقم الأيدي التي ترتدي القفازات ، ومعقم الخرز إذا تم اختراق عقم الأداة ، أو بين العمليات الجراحية الفردية.

4. تعريض العمود الفقري وتحديد موقع استئصال الصفيحة

1. الفقرية حدد المنطقة التي سيتم فيها إجراء شق جلدي عن طريق الضغط على الأصابع برفق في الضلع الأخير لتحديد موقع الخشب أو الفقرة L1. باستخدام هذا كمعلم ، قم بعمل شق جلدي بطول 3-4 سم مع مشرط جراحي # 10 ينتهي أدنى من L1 لفضح العضلات. امسك الجلد مشدودا عن طريق دهنه برفق والضغط عليه بقوة بشفرة المشرط لضمان شق نظيف.
2. قطع ونشر الدهون السطحية بالملقط والمقص إذا لزم الأمر. (اعتمادا على الفقرة المستهدفة ، قد يكون هناك أو لا يكون هناك وسادة دهنية كبيرة سطحية للعضلة.)
3. اشعر بالعمليات الشائكة باستخدام شقة شفرة المشرط أو الإصبع. في كثير من الأحيان ، سيتم تحديد منطقة خط الوسط بواسطة حرف "V" من اللفافة البيضاء على كلا الجانبين. قم بعمل قطع منقاري صغير للسماح للمساحة بالامساك بإحكام بالعملية العلوية باستخدام ملقط أسنان الفئران ، ثم قم بعمل قطعتين طويلتين وعميقتين بالقرب من العمليات قدر الإمكان. في أعمق نقطة من القطع ، يمكن الشعور بالسطح الظهري للفقرات بشفرة المشرط.
4. امسك العضلات الجانبية جانبا باستخدام مباعدات أو خطافات مرجحة لتحسين الرؤية. قم بمسح العضلات حول العمليات باستخدام مشرط أو مقص زنبركي أو rongeurs لتحديد شكل رؤوسهم.
   NOTE: تذكر أن الحبل الشوكي لا يمتد بطول العمود الفقري بالكامل ، حيث يتوقف نسيج الحبل الشوكي عن النمو في وقت مبكر من العظام. هذا يعني أن مستوى العمود الفقري المستهدف قد يكون تحت فقرة مختلفة الاسم.
5. حدد موقع الصدر أو T11 والعمليات المجاورة T12 و T13.
   ملاحظة: يمكن العثور على المساعدة في استهداف مستويات العمود الفقري الصحيحة في أطلس الحبل الشوكي للفئران والدراسات السابقة التي تحدد المعالم في الفأر ، الذي له بنية فقرية مشابهة جدا 6،33. اترك عملية شوكة منقارية ، مثل T9 ، دون إزعاج لإعطاء معلم في خط الوسط.

5. إجراء استئصال الصفيحة

الفقرية

1. بمجرد تحديد المنطقة المستهدفة بشكل صحيح ، قم بإجراء عمليات استئصال الصفيحة الفقرية للجوانب الظهرية ل T11-T13. انشر الفقرات برفق للكشف عن الأربطة الفقرية ، وهي مواقع جيدة لإدخال الرونجور للعضة الأولية للعظام. أمسك الرونج في وضع نصف مغلق لزيادة التحكم الدقيق.
2. قم بإزالة العمليات الشائكة والجانب الظهري للفقرات عن طريق أخذ لدغات صغيرة مع الرونجور. احرص على عدم إتلاف الحبل الشوكي أو إزعاج الجافة. ارفع قليلا باستخدام ملقط أسنان الفئران للمساعدة في سحب الحبل الشوكي بعيدا عن الفقرات وتقليل الميل إلى ضرب أنسجة الحبل الشوكي.
3. قم بإزالة العظم بعيدا عن خط الوسط بحيث يمكن ملاحظة الأوعية الدموية في خط الوسط. اترك نافذة تظهر بوضوح أنسجة الحبل الشوكي وخالية من الحطام.
4. المس الحبل الشوكي برفق باستخدام ملقط. قد تقفز بعض بشكل انعكاسي حتى لو كانت طائرات التخدير عميقة. ضع بضع قطرات من عامل مخدر ، مثل الليدوكائين ، مباشرة على الحبل الشوكي لمنع القفز أثناء إجراء الحقن.
5. قم بتأمين في حامل العمود الفقري عن طريق تثبيت ملقط التثبيت على العمليات الشائكة المنقارية والذيلية في نافذة استئصال الصفيحة الفقرية. ارفع بطن باستخدام حامل العمود الفقري لإبطال تأثير حركات التنفس. سيؤدي ذلك إلى زيادة ثبات الإبرة وضمان عمق الحقن المناسب.

6. تحميل الفيروس ووضع الحاقن

1. قم بتحميل الفيروس في الحاقن عن طريق سحب ما يقرب من 5 ميكرولتر على قطعة من البارافيلم ووضع الإبرة بحيث يكون الطرف داخل القطرة.
2. استخدم المضخة الدقيقة لسحب ما يصل إلى 4 ميكرولتر من الفيروس بمعدل 20-100 نانولتر / ثانية.
3. اضبط وحدة التحكم لحقن كمية صغيرة من الفيروس وإطلاقها من الإبرة لضمان عدم انسداد طرف الإبرة. امسح الفيروس الزائد بمسحة معملية.
   ملاحظة: يمكن استخدام حقنة هاميلتون بإبرة فولاذية كبديل للماصات الزجاجية المسحوبة.
4. ضع المعالج الدقيق بحيث يكون مقياس Vernier مرئيا ، وضع الإبرة في خط الوسط للحبل الشوكي.
   ملاحظة: يمكن أحيانا تحديد موقع خط الوسط بواسطة وعاء دموي كبير يعمل على السطح الأمامي للحبل الشوكي. ومع ذلك ، يمكن أن يختلف هذا في الفئران الفردية ، ويجب تأكيد استهداف خط الوسط بالمقارنة مع عملية شائكة سليمة.
5. قم بتوجيه الإبرة بشكل جانبي بمقدار 0.8 مم باستخدام مقياس Vernier على المعالج الدقيق.
6. اخفض الإبرة إلى الحبل الشوكي حتى تثقب الجافية ، ولكن لا تثقبها. باستخدام حركة التواء سريعة ، قم بثقب الجافية بالإبرة حتى تغرق على عمق 1.5 مم.

7. حقن الفيروس في النخاع الشوكي

1. بمجرد وضع الإبرة في مكانها ، قم ببرمجة الحاقن للحقن بمعدل 400 نانولتر / دقيقة. تأكد من دخول الفيروس إلى الحبل الشوكي من خلال مراقبة تقدم واجهة الصبغة. يجب ألا يكون هناك تسرب واضح أو انتفاخ في أنسجة الحبل الشوكي. إذا لوحظ تسرب ، فيمكن في بعض الأحيان التخفيف من ذلك عن طريق تقليل سرعة الحقن إلى 200 نانولتر / دقيقة.
2. بمجرد الانتهاء من الحقن ، اترك الإبرة ترتاح في الحبل الشوكي لمدة 2-5 دقائق (حسب الحجم المحقون) لتسهيل انتشار الفيروس.
3. اسحب الإبرة ببطء وانتقل إلى موقع الحقن التالي. حقن 1 ميكرولتر من الفيروس في كل من 6 مواقع متباعدة بشكل متساو على بعد 1 مم تقريبا على طول الأنسجة الشوكية L1-L4. يمكن استخدام نفس الإبرة لكل حقنة طالما أنها تستمر في العمل بشكل صحيح.

8. إغلاق الجرح ورعاية ما بعد الجراحة

1. قم بإزالة من حامل العمود الفقري وأخرج الضواعق أو الخطافات المستخدمة لنشر العضلات الجانبية. تأكد من خلو الجرح من جميع الحطام قبل الإغلاق.
2. خياطة العضلة باستخدام خياطة catgut 4.0 chromic. قطع خيوط الخياطة بالقرب من العقدة لتقليل احتمالية تهيج الجلد الداخلي.
3. قم بتدبيس الجلد بإغلاقه باستخدام مشابك الجرح مقاس 9 مم. للسماح بالشفاء الأمثل ، قم بمحاذاة حواف الجلد قبل التدبيس.
4. ضع على وسادة تسخين الحمل الحراري المائي وراقبه حتى الاستيقاظ.
5. حقن 5-10 مل من المحلول الملحي المعقم تحت الجلد لتجديد السوائل ومضاد حيوي مثل سيفازولين للوقاية من العدوى. عندما يكون متنقلا ، ضعه مرة أخرى في قفص منزله وقدم المسكنات الأولية. راقب الفئران بحثا عن أي علامة على الألم والضيق ، وعالج وفقا للإجراء المعتمد من لجنة رعاية واستخدامها المؤسسية (IACUC) لتخفيف الألم.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات # 10 Scalpel BladesRobozRS-9801-10للاستخدام مع المشرط.1 مل محاقنبيكتون وديكنسون وشركاه309659لحقن IP المخدر ، والجرعات المعززة للتخدير ، وحقن المضادات الحيوية.10 مل محاقنبيكتون وديكنسون وشركاه309604لحقن المحلول الملحي في ، بعد الجراحة.4.0 خياطة الكروم CatgutDemeTECHNN374-16لإعادة ربط العضلات أثناء الإغلاق.48000 Micropipette BevelerWorld Precision Instruments32416تستخدم لشطبة أطراف الأنابيب الزجاجية الشعرية المسحوبة لتشكيل إبر زجاجية وظيفية.5٪ محلول اليودمنتجات بوردو LPL01020-08للاستخدام في تعقيم موقع الجراحة.70٪ إيثانولN / AN / Aلتعقيم الإبر الزجاجية المعدة حديثا ، والنماذج الحيوانية أثناء التحضير الجراحي ، وأيدي الجراح أثناء الجراحة ، بالإضافة إلى جميع عمليات الصيانة الطفيفة الأخرى للعقم.مخدر (محلول الكيتامين / الزيلازين)Zoetis240048لإبقاء في مستوى الوعي الصحيح أثناء الجراحة.مضاد حيوي (سيفازولين) ويست وارد للمستحضرات الصيدلانيةNPC 0143-9924-90يتم حقنه تحت الجلد لمنع العدوى بعد الجراحة.معقم حبةCellPoint5-1450لتعقيم الأدوات الجراحية بالحرارة.أدوات العلوم الدقيقة لشمع العظام19009-00لإغلاق العظام في حالة نزيف العظام.أدوات العلوم الدقيقة للكي18010-00لإغلاق أي شرايين أو أوردة مقطوعة أثناء الجراحة لمنع فقدان الدم المفرط.ميزان رقميOkausREV.005لوزن أثناء التحضير الجراحي.مرفق إبرة مرنةأدوات الدقة العالميةMF34G-5لتنظيف الإبر الزجاجية وتحميل الزيت الأحمر في الإبر الزجاجية.GelfoamPfizerH68079لإغلاق العظام في حالة نزيف العظام.أنابيب الشعرية الزجاجيةأدوات الدقة العالمية4878للإبر الزجاجية المسحوبة - يجب أن تكون مصممة لحاقن النانولتر.ماكينة قص الشعرOster111038-060-000لتطهير موقع الجراحة من الشعر.HemostatsRobozRS-7231للاستخدام العام في الجراحة.KimwipesKimtech34155للاستخدام العام في الجراحة.ملقط منحني متوسط النقطةRobozRS-5136للاستخدام العام في الجراحة.معالج دقيق بمقياس ورنيةKanetecN / Aللاستهداف الدقيق أثناء الجراحة.مقص دقيقRobozRS-5621لقطع الهمسات الزجاجية من الأنابيب الشعرية الزجاجية المسحوبة حديثا.مجهر بمقياس الضوء والورنية العينLeitz WetzlarN / Aيستخدم لتصور وقياس شطف الأنابيب الزجاجية الشعرية المسحوبة في إبر زجاجية وظيفية.وحدة تحكم مضخة الحقنالدقيقة العالمية للأدواتالدقيقة 62403للتحكم في معدل الحقن.Nanoliter 2000 حاقن رأس المضخةالعالمية للأدوات الدقيقة500150لتحميل وحقن الفيروس بطريقة خاضعة للرقابة.مجتذب إبرةNarishigePC-100لتسخين وتفكيك الأنابيب الشعرية الزجاجية لتشكيل إبر زجاجية.مرهم العيونDechra المنتجات البيطريةRAC 0119لحماية عيون أثناء الجراحة.ParafilmBemisPM-996للمساعدة في تحميل الفيروس في حاقن النانو.إبر PrecisionGlide (25 جم × 5/8)305122 Becton و Dickinson and Companyللاستخدام مع المحاقن سعة 1 مل و 10 مل للسماح بحقن النموذج الحيواني.ملقط أسنان الفئرانRobozRS-5152لإمساك العمليات الشائكة.زيت أحمرN / AN / Aلتوفير واجهة لتصور الفيروس الذي يدخل الأنسجة أثناء الحقن.مباعداتRobozRS-6510لفتح الجرح الجراحي.أقراص ريماديلبيو سيرفMP275-050لإدارة الألم بعد الجراحة.RongeursRobozRS-8300لإزالة العضلات من العمود الفقري أثناء الجراحة.مقبض شفرة مشرطRobozRS-9843لتقطيع الجلد المفتوح ووسادة الدهون لنموذج أثناء الجراحة.مقصRobozRS-5980للاستخدام العام في الجراحة.مشابك الجرح السرقة غير القابل للصدأCellPoint201-1000لربط جلد الجرح الجراحي أثناء الإغلاق.ملقط إزالة الدبابيسكينت ScientificINS750347لإزالة الدبابيس ، يجب تطبيقها بشكل غير صحيح.قماش معقمPhenix Research ProductsBP-989لتوفير سطح معقم للعملية.أدوات تطبيق معقمة من القطنPuritan806-WCلامتصاص الدم في الجرح الجراحي مع الحفاظ على العقم.شاش معقمCovidien2146لتنظيف المنطقة الجراحية والأدوات الجراحية مع الحفاظ على العقم.شركة Sterile SalineBaxter HealthcareCorporation 281324للاستخدام في تنقية الدم واستبدال السوائل بعد الجراحة.قفازات جراحيةN / AN / Aللاستخدام من قبل الجراح للحفاظ على المجال المعقم أثناء الجراحة.وسادة التسخين الجراحيةN / AN / Aللحفاظ على درجة حرارة جسم النموذج الحيواني أثناء الجراحة.المجهر الجراحيN / AN / Aلتحسين الرؤية للجرح الجراحي.دباسة جراحيةكينت INS750546 العلميةلتطبيق الدبابيس.T / مضخة مضخة مياه العلاج الحراريGaymarTP500Cلضخ الماء الدافئ في وسادة تسخين الحمل الحراري.وسادة تسخين الحمل الحراري للمياهشركة باكستر للرعاية الصحيةL1K018للاستخدام في منطقة التعافي بعد العملية للحفاظ على درجة حرارة جسم الفاقد للوعي.خطافات مرجحةN / AN / Aلفتح الجرح الجراحي.