الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة لمنع إمكانات عمل الأعصاب في نموذج الفئران السكري

الملخص

المصدر: Lee، Y. F.، et al. أداة بالموجات فوق الصوتية لكتلة التوصيل العصبي في نماذج الفئران السكرية. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو استخدام الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة (HIFU) لمنع إمكانات العمل من العصب الوركي إلى عضلة المعدة في نموذج الفئران السكري. عند توصيل شعاع HIFU إلى العصب ، يؤكد انخفاض إشارة العضلات إمكانات HIFU كعلاج غير جراحي لتخفيف آلام الاعتلال العصبي السكري.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. انسداد التوصيل العصبي في الجسم الحي باستخدام محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة (HIFU)

ملاحظة: تبدأ التجربة في الجسم الحي في الأسبوع 5 بعد حقن 50 مجم / كجم من الستربتوزوتوسين (STZ).

1. قم بإجراء إجراءات حيوانية قبل منع إمكانات عمل العضلات المركبة (CMAPs) باستخدام صوتنة HIFU.
   1. تعقيم الأدوات الجراحية (مشرط ، مقص ، ملقط ، وخطاف زجاجي) في الأوتوكلاف قبل الجراحة.
   2. تخدير الفئران بحقن داخل الصفاق من خليط التيليتامين / زولازيبام (40 مجم / كغ) والزيلازين (10 مجم / كغ) أو عن طريق استنشاق 1.75٪ من الأيزوفلوران عن طريق مبخر الأيزوفلوران. ضع الفئران على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة أجسامها.
   3. ضع الفئران لإجراء عملية جراحية في الاستلقاء البطني. ضع مرهم العين. مد ساق الجرذ واضغط على السطح الأخمصي للقدم بأظافر للتأكد من عمق التخدير. إذا أظهرت الفئران استجابات انسحاب ، فقم بتطبيق تخدير إضافي.
   4. قم بإزالة الشعر من الفخذ وأسفل ظهر الفئران باستخدام مقص كهربائي. ضع اليود السائل بشاش نظيف في موقع الجراحة وحرك الشاش بشكل دائري إلى الخارج من موقع الجراحة. استخدم وسادة كحولية لمسح اليود السائل بنفس الحركة الدائرية. يتم إجراء هذه التجربة في مواقع الجراحة اليمنى واليسرى. كرر الإجراء في موقع الجراحة الآخر عند تنفيذ الخطوة التالية من الإجراء.
   5. استخدم مقصا جراحيا معقما أو مشرط لعمل شق في الجلد في الفخذ الظهري. استخدم مقصا جراحيا غير حاد لفصل الأنسجة الموجودة تحت الجلد بعناية وتأمين الجلد بخطافات جلدية. يمكن رؤية عظم الفخذ داخل العضلات.
   6. استخدم المقص لفصل العضلات الموازية لعظم الفخذ بعناية حتى تظهر الألياف العصبية الوركي في منتصف الفخذ المضمنة في العضلات. استخدم خطافا زجاجيا بعناية لفصل العصب الوركي في منتصف الفخذ عن الأنسجة والعضلات الضامة المحيطة.
2. ضع العصب الوركي في المنطقة البؤرية HIFU باستخدام مثبت عصبي مخصص (الشكل 1 والشكل 2).
   ملاحظة: يتكون مثبت العصب المخصص من 3 مكونات (الشكل 2). جميع المكونات مصنوعة من بولي ميثيل ميثاكريلات شفاف (PMMA). يبلغ طول الخيط الخارجي للهيكل العلوي للمكون I 2.5 مم و M10XP0.7 (الشكل 3 أ). البئر المركزي عبارة عن ثقب قطره 4.0 مم من خلال المكون الأول. الفتحة السفلية للبئر مختومة بورقة من الشريط. يبلغ قطر الفتحة 1.2 مم ، والمسافة بين المستوى المركزي للفتحة والسطح العلوي للمكون I هي 3.1 مم. يتكون المكون الثاني من جسم رئيسي وأربعة أرجل وهيكل سفلي (الشكل 3 ب). يبلغ طول الخيط الداخلي للهيكل السفلي 2.5 مم و M10XP0.7 ليناسب الخيط الخارجي للمكون الأول. قطر الثقب المركزي هو نفس البئر المركزي للمكون الأول. يبلغ قطر الجسم الرئيسي 32 مم وسمكها 5.4 مم. يتم نشر أربعة أرجل بشكل متماثل. تم تصميم ساقين قصيرتين متطابقتين للمحاذاة ، وتعمل ساقان طويلتان متطابقتان على التثبيت على المكون الثالث. القطر الخارجي وارتفاع المكون الثالث هو 41 مم و 9.2 مم. الخيط الداخلي هو M36XP1.0 ، ويبلغ قطر الفتحة 27.5 مم (الشكل 3C). المخروط عبارة عن تفتق مجوف بفتحة علوية يبلغ قطرها 84 مم وفتحة سفلية قطرها 27.5 مم. الارتفاع 57.5 ملم (الشكل 4 أ).
   1. قبل التجربة ، انقع مثبت العصب الأكريليكي المصنوع خصيصا في محلول التبييض لمدة 30 - 60 دقيقة ، متبوعا بالنقع في ماء معقم.
   2. باستخدام خطاف زجاجي ، ارفع العصب بعناية وضعه في فتحة المكون الأول.
   3. المكون اللولبي الثاني إلى المكون الأول. املأ البئر المركزي للمكون الأول بمحلول Ringer للانتشار بالموجات فوق الصوتية والحفاظ على الأعصاب.
   4. برغي المكون III إلى مخروط الإسكان HIFU. مكون قفص الاتهام III مع المكون الثاني من خلال الأرجل الأربعة للمكون II.
      ملاحظة: يتم محاذاة المركز الهندسي للمكونات الثلاثة ومحول الطاقة. المسافة بين العصب ومحول الطاقة تساوي البعد البؤري ، مما يضمن وجود العصب داخل المنطقة البؤرية HIFU.
3. أدخل زوجا واحدا من إبر الوخز بالإبر في أصل العصب الوركي والزوج الآخر في عضلة المعدة الوركي. قم بتوصيل كل زوج من الإبر بنظام اكتساب الفيزيولوجيا الكهربية من خلال كابل متحد المحور الكهربائي (الشكل 1).
   ملاحظة: يوجد على أحد طرفي الكابل مقطعان من التمساح لقص إبرتين بشكل منفصل ، وعلى الطرف الآخر من الكبل يوجد موصل حربة نيل كونسيلمان (BNC) لربط النظام. تعمل أزواج إبر الوخز بالإبر كأقطاب كهربائية محفزة في العصب الوركي وأقطاب التسجيل في عضلة المعدة.
   1. اضبط معدل أخذ العينات وعرض النطاق الترددي لنظام اكتساب الفيزيولوجيا الكهربية على 50 كيلو هرتز و 70 هرتز -3 كيلو هرتز ، على التوالي. ضع حافزا فوق الحد الأقصى بعرض نبضة يبلغ 0.1 مللي ثانية على الأقطاب الكهربائية المحفزة في أصل العصب الوركي.
   2. قم بتسجيل CMAPs من أقطاب التسجيل وتضخيم CMAPs باستخدام مكبر الصوت المدمج في نظام اكتساب الفيزيولوجيا الكهربية.
      ملاحظة: استخدم مكبر الصوت المدمج في نظام اكتساب الفيزيولوجيا الكهربية لتضخيم الإشارات العصبية وتسجيل CMAPs من أقطاب التسجيل باستخدام نظام اكتساب الفيزيولوجيا الكهربية.
4. استخدم محول طاقة HIFU تجاري 2.68 ميجاهرتز لقمع CMAPs في الفئران المصابة بالاعتلال العصبي السكري.
   ملاحظة: يتم وصف مواصفات محول الطاقة على النحو التالي: وعاء كروي أحادي العنصر بقطر فتحة 6 سم وطول بؤري 5 سم ، ومنطقة بؤرية بيضاوية الشكل بعمق 4 مم وعرض 0.8 مم في المجال الحر.
   1. اغمر المخروط الكروي ومحول الطاقة HIFU والغطاء المخروطي في الخزان المملوء بالماء منزوع الغاز. ضع محول الطاقة HIFU في المخروط الكروي وقم بتثبيت الغطاء المخروطي على الفتحة العلوية للمخروط الكروي بستة براغي رأس (الشكل 4 ب). بعد طرد الفقاعات الموجودة في المخروط الكروي بشكل طبيعي بسبب انخفاض كثافة الفقاعات مقارنة بالماء ، أغلق الفتحة الأمامية للمخروط بشريط شفاف بسمك 0.03 مم. المسمار المكون الثالث على المخروط الكروي.
   2. أخرج محول الطاقة HIFU مع المخروط الكروي والمكون الثالث من خزان المياه المنزوعة.
      ملاحظة: ماء التناضح العكسي (RO) المستخدم في الدراسة هو الماء المنقى عن طريق عملية التناضح العكسي. يتم غلي ماء التناضح العكسي لطرد الغاز. بعد التبريد ، يتم الحصول على الماء المنزوعة من الغاز في خزان فردي مغلق.
5. ضع المكون الأول في الفراغ بين العصب والعضلة بعناية ، وضع العصب في فجوة المكون I. قم بتنفيذ الخطوتين 1.2.3 و 1.2.4 للتأكد من أن العصب داخل المنطقة البؤرية ل HIFU (الشكل 2 أ).
6. اربط مولد دالة ومضخم طاقة الترددات الراديوية. قم بتوصيل مضخم الطاقة بمحول الطاقة HIFU لتوليد شعاع HIFU. اضبط خرج الجهد لمولد الوظيفة يدويا على محول الطاقة HIFU عبر مضخم الطاقة. قم بإيقاف تشغيل مولد الوظائف يدويا بمجرد انتهاء وقت التعرض ل HIFU. راقب الوقت باستخدام جهاز توقيت.
   ملاحظة: شدة وطاقة شعاع HIFU المستخدم في هذه الدراسة هي 2,810 واط / سم² و 84 جول / مم² ، على التوالي.
7. في الوقت نفسه ، قم بتوصيل الحافز عبر نظام اكتساب الفيزيولوجيا الكهربية (الخطوة 1.3) وشعاع HIFU عبر نظام HIFU (الخطوة 1.6) إلى العصب الوركي أثناء تسجيل CMAPs. قم بزيادة التعرض ل HIFU تدريجيا على العصب الوركي من 3 ثوان ، 5 ثوان إلى 8 ثوان حتى لوحظ انخفاض أو تثبيط سعة CMAPs.
   1. سجل CMAPs مرة واحدة في الثانية أثناء تسليم شعاع HIFU. بعد ملاحظة التغيير في سعة CMAPs ، قم بإيقاف تشغيل نظام HIFU وانقر يدويا على أيقونة التسجيل في برنامج اكتساب الفيزيولوجيا الكهربية لتسجيل CMAPs كل دقيقتين في أوائل 10 دقائق ، وكل 5 دقائق في 30 دقيقة متتالية ، وكل 10 دقائق في المرحلة الأخيرة حتى يصل وقت التسجيل إلى ساعتين.
8. افصل المكونان الثاني والثالث من مثبت العصب (الشكل 2) لإزالة محول الطاقة HIFU من موقع الشق. المكونات المنفصلة الثاني والأول لتحرير العصب الوركي الآمن. خياطة الموقع الجراحي للفأر المصاب بالسكري ب 4-0 خيوط من القطط الكرومية بعد تسجيل CMAPs. ضع اليود السائل على موقع الجراحة لمنع العدوى.
   1. ضع الأقفاص على وسادة التدفئة واسمح للفئران بالتعافي في أقفاصها قبل إعادتها إلى منشأة. تزويد الفئران بالإيبوبروفين في مياه الشرب لمدة 3 أيام أو حقن داخل الصفاق من البوبرينورفين (0.05 - 0.1 مجم / كغ).
9. أدخل أقطاب كهربائية محفزة وتسجيل في أصل العصب الوركي وعضلات المعدة للفئران العصبية السكرية المخدرة كما هو موضح في الخطوات 1.1.2 و 1.3 في الأيام 7 و 14 و 28 بعد صوتنة HIFU الأولية.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image_resized image-style-align-center' style='display: table؛ margin-left: auto ؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: الإعداد التجريبي لكتلة التوصيل العصبي في الجسم الحي مع الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة (HIFU). (أ) تم دمج مخروط كروي أكريليك مصنوع خصيصا مملوءا بالماء المنزوغ من الغازات بالتناضح ال...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات StreptozotocinSigma85882Biopac MP36 الاستحواذ على نظامBiopac Systems، Inc. محول الطاقة HIFUSonic ConceptsH108مولد وظيفةAgilent33250Aمضخم الطاقةالإلكترونيات والابتكار1040 لترالفئرانBiolasco تايوانSprague-DawleyPuralube مرهم بيطريDechra Isoflurane مبخرباركلاند العلميV3000PSIsofluraneعطاني