تصوير ديناميكيات الكالسيوم تحت الخلايا في الخلايا العصبية لالتهاب الغدة المائية

الملخص

المصدر: Doser، R.، et al. التصوير تحت الخلوي لمعالجة الكالسيوم العصبي في الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2023)

يوضح هذا الفيديو التصوير في الجسم الحي لتدفق الكالسيوم تحت الخلوي في الخلايا العصبية في الحبل العصبي البطني لسلالات Caenorhabditis elegans المعدلة وراثيا. يتم استخدام مؤشرين متميزين للكالسيوم: مؤشر سيتوبلازمي في سلالة واحدة ومؤشر الميتوكوندريا في سلالة أخرى. لوحظت الخلايا العصبية تحت المجهر الفلوري لمراقبة التغيرات في الوقت الفعلي في شدة التألق داخل السيتوبلازم العصبي والميتوكوندريا ، مما يعكس تدفق الكالسيوم أثناء النشاط العصبي التلقائي.

البروتوكول

1. تحضير الديدان للتصوير

1. تحضير وسادات أجار
   1. اصنع 3 مل من أجار 10٪ عن طريق إذابة أجار الدرجة الجزيئية في M9 في أنبوب ثقافة زجاجي مقاس 13 مم × 100 مم وميكروويف لعدة ثوان.
      ملاحظة. يمكن الاحتفاظ ب Molten agar على كتلة حرارية لمدة تصل إلى 1 ساعة أو يمكن جعله طازجا في كل مرة تكون فيها هناك حاجة إلى ضمادات أجار.
   2. ضع شريحة مجهر بين شريحتين إضافيتين تحتوي كل منهما على طبقتين من شريط المختبر (انظر الشكل 1A-i).
   3. قم بقص طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر (بدون مرشح) واستخدمه لسحب قطرة صغيرة من الأجار على زلة الغطاء المركزية (الشكل 1A-i).
   4. قم بتسطيح الأجار بالضغط على شريحة أخرى لأسفل أعلى الأجار (الشكل 1 أ - 2).
   5. بعد التبريد ، قم بتقطيع الأجار إلى قرص صغير باستخدام فتحة أنبوب ثقافة زجاجي مقاس 13 مم × 100 مم (الشكل 1A-iii) ، ثم قم بإزالة الأجار المحيط.
2. تحضير محلول دحرجة الدودة
   1. قم بإذابة مسحوق muscimol في M9 لإنشاء مخزون 30 ملم. افصلها إلى 50 ميكرولتر ، وخزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   2. قم بإذابة كمية جديدة من 30 ملي مولار موسيمول كل 3-5 أيام (وتخزينها في درجة حرارة 20 درجة مئوية أثناء الاستخدام).
   3. قم بتخفيف مخزون الموسيمول 30 ملي مولار بنسبة 1: 1 بخرز البوليسترين لعمل محلول الدرفلة.
3. وضع دودة للتصوير
   1. ضع 1.6 ميكرولتر من محلول الدرفلة على مركز وسادة أجار.
      ملاحظة: يجب ضبط كمية السائل لتصوير الأصغر سنا (أقل) أو الأكبر سنا (أكثر).
   2. باستخدام اختيار الدودة المفضل (أي اختيار من الزجاج أو الأسلاك البلاتينية) ، انقل دودة من العمر المطلوب بدون النمط الظاهري متعدد الفرج إلى محلول التدحرج على وسادة الأجار (الشكل 1 أ - رابعا). ملاحظه. البيانات التمثيلية مأخوذة عمرها يوم واحد (سلالة GCaMP6f = FJH185 ؛ سلالة mitoGCaMP ؛ FJH597) ، والتي يمكن التعرف عليها من خلال وجود صف واحد فقط من البيض.
   3. انتظر لمدة ~ 5 دقائق حتى يقلل الmuscimol من حركة الدودة ، ثم قم بإسقاط غطاء 22 مم × 22 مم أعلى وسادة أجار ، مما يحد فعليا من حركة الدودة.
   4. لتصوير الخلايا العصبية في الحبل العصبي البطني ، قم بلف الدودة في الاتجاه الموضح في الشكلين 1B و 1C عن طريق تحريك الغطاء ><برفق. لتصور الحبل العصبي البطني ، ضع الدودة مع الرأس لأعلى ، ولف الدودة حتى تصبح الأمعاء على الجانب الأيمن من الجزء القريب واليسار للجزء البعيد من الدودة (من منظور المشاهد). اقلب هذا الاتجاه (الشكل 1C) لتصوير الخلايا العصبية في الحبل العصبي الظهري.
4. تركيب الدودة على المجهر
   1. ضع قطرة من زيت الغاطس على الغطاء قبل تثبيته على مرحلة المجهر.
   2. أوجد المتنقلة باستخدام هدف تكبير منخفض (10x) في المجال الساطع.
   3. قم بالتبديل إلى الهدف 100x واضبط التركيز.
   4. حدد موقع AVA neurite باستخدام إضاءة GCaMP أو mitoGCaMP باستخدام ليزر التصوير 488 نانومتر.
      NOTE: استخدم تعديلات صغيرة لمنع سحق الدودة أو سحب الغطاء.

2. الحصول على تدفقات صور عالية الدقة

1. في الجسم الحي تصوير GCaMP
   1. اضبط وقت التعرض على 20 مللي ثانية.
   2. اضبط إعدادات ليزر التصوير والاكتساب حتى يصبح مضان GCaMP القاعدي في النطاق المتوسط للنطاق الديناميكي للكاميرا. ارجع إلى المناقشة للحصول على اقتراحات حول تحسين معلمات التصوير باستخدام إعدادات الفحص المجهري الأخرى.
      ملاحظة: بالنسبة للإعداد البصري المستخدم في هذه الدراسة ، اضبط ليزر التصوير 488 نانومتر على إعدادات الإخراج التالية: طاقة الليزر = 50٪ والتوهين = 1. قم بتعديل إعدادات الاستحواذ الإضافية على النحو التالي: مضاعفة الإلكترون EM) الكسب = 200 وكسب المضخم المسبق = 1.
   3. بعد تحديد موقع AVA neurite باستخدام مضان GCaMP بتكبير 100x ، اضبط مصحح الانجراف Z (ZDC ، انظر جدول المواد) على نطاق ±30 ميكرومتر ، وابدأ التركيز التلقائي المستمر. قم بتصحيح المستوى البؤري يدويا حسب الحاجة قبل التصوير.
   4. احصل على دفق من الصور بتكبير 100x. يمكن تحقيق فترات تصل إلى 10 دقائق من خلال الإعداد المستخدم في هذه الدراسة.
2. في الجسم الحي mitoGCaMP imaging
   1. اتبع الخطوات 2.1.1 - 2.1.2 حسب الحاجة للحصول على مضان mitoGCaMP القاعدي في النطاق الديناميكي للكاميرا.
      NOTE. بالنسبة للإعداد البصري المستخدم في هذه الدراسة ، اضبط ليزر التصوير 488 نانومتر على إعدادات الإخراج التالية: طاقة الليزر = 20٪ والتوهين = 10. قم بتعديل إعدادات الاستحواذ على ما يلي: كسب EM = 100 وكسب مضخم ما قبل = 2.
   2. بعد تحديد موقع الميتوكوندريا في نيورويت AVA باستخدام مضان mitoGCaMP ، اضبط ZDC كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.3.
   3. احصل على دفق من الصور بتكبير 100x.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image_resized image-style-align-center' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: تركيب ولف C. ايليجانس لتصوير الحبل العصبي البطني. (أ) رسم توضيحي لخطوات تحضير وسادات الأجار وقطف دودة واحدة في محلول متدحرج. (ب) مثال على وضع الدودة...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 100x / 1.40 Oil ObjectiveOlympus UPlanSApo10x / 0.40 ObjectiveOlympus UPlanSApo22 مم × 22 مم غطاء زجاجيVWR48366-227 Agarose SFRVWRJ234-100G CleanBench طاولة مختبرTMC مع التحكم في الاهتزازعجلة المرشح أو المنزلقASI لمرشحات قطرها 25 ممFJH 185مركز Caenorhabditis لعلم الوراثةFJH 185سلالة الدودةFJH 597Caenorhabditis Genetics CenterFJH 597سلالة الدودةGFP مرشح انبعاث ممر النطاقالترددي Chroma 525 ± 50 نانومتر (قطر 25 مم)مجمع ليزر ILEAndor Technologies 4 خطوط ليزرILE الحالة الصلبة 488 نانومترليزر Andor Technologies 50 ميجاواتIX83 مجهر ثنائي البؤر القرصالغزل أوليمبوس مع قرص الغزل Yokogawa CSU-X1كاميرا iXon Ultra EMCCDAndor Technologies زيت الغمر المنخفض الفلورةالتلقائية OlympusZ-81226 MetaMorphMolecular Devices الإصدار 7.10.1صندوق التحكم المجهرأوليمبوس IX3-CBHMuscimolMP الطب الحيوي / سيجما02195336-CF الكريات المجهرية Polybeadشركة Polysciences00876-150.094 ميكرومترغرفة الاستقرارNorlake ScientificNSRI241WSW / 8Hضبط على 15 درجة مئويةوحدة تحكم المرحلةASI مع التحكم في عجلة المرشحشريحة المجهر القياسيةPremiere9108W-E75 مم × 25 مم × 1 مموحدة تحكم في لوحة اللمسمصحح الانجراف Olympus I3-TPCZأوليمبوس IX3-ZDC2