زرع خلايا السلائف بين الخلايا العصبية في دماغ جرو الفأر

الملخص

المصدر: Quattrocolo، G.، et al. الزرع المتجانس المزمن لسلائف الخلايا العصبية الداخلية في أدمغة الفئران المبكرة بعد الولادة. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو زرع خلايا السلائف العصبية الداخلية في دماغ الفأر حديثي الولادة باستخدام نهج متجانس أو غير متجانس. يتضمن الإجراء تأمين جرو متلقي مخدر ، وتحديد منطقة الدماغ المستهدفة ، وحقن تعليق الخلايا السليفة المشتقة من جرو متبرع في نفس مرحلة النمو. بعد الحقن ، يتم نقل الجرو إلى وسادة تسخين للتعافي ، مما يسمح بالتقييم اللاحق لبقاء الخلايا المانحة ونضجها.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إزالة دماغ الفأر P0-P2

1. قبل بدء الإجراء مباشرة ، املأ العديد من أطباق بتري بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي الكربوهيدراتي المبرد والكربوهيدراتي المؤكسج (sACSF). املأ أيضا أنبوب (أنبوب) التجميع ب ~ 25 مل sACSF.
2. لف جرو ما بعد الولادة من 0 إلى 2 (P0-P2) في بعض البارافيلم أو القفاز وضعه مغطى جيدا تحت الجليد. اضبط مؤقتا لمدة 5 دقائق وابدأ تشغيله. بعد ذلك الوقت ، قم بإزالة الجرو وتأكد من أنه لا يستجيب لقرص المخلب الخلفي.
3. اقطع رأس الجرو واجمع الرأس في طبق بتري مليء ب sACSF. قطع الجلد على طول خط الوسط لفضح الجمجمة.
4. حدد موقع الفتحة الموجودة في الجمجمة في الدماغ الخلفي/الحبل الشوكي وأدخل أحد طرفي الملقط على طول الجزء الظهري من الجمجمة. أمسك الجمجمة برفق عند خط الوسط و "قشر" القطع بشكل جانبي لكشف الدماغ ، مع الحرص على عدم إتلاف الدماغ.
5. عند إزالة الأجزاء الظهرية والجانبية من الجمجمة ، استخدم الملقط أو الملعقة لإزالة الدماغ برفق من الجمجمة عن طريق الغرف تحت السطح البطني للدماغ ، في محاولة لعدم إتلاف أي منطقة. ضع الدماغ في طبق بتري آخر مليء ب sACSF الكربوهيدراتي المؤكسج. ملاحظه: نقدم استراتيجيتين مختلفتين لتشريح الحصين والمخطط والقشرة. الإستراتيجية الأولى (الخطوات 2.1-2.10) مفيدة لأي خط فأر بينما تحتاج الإستراتيجية الثانية (الخطوات 3.1-3.7) إلى فأر مراسل فلوري لفصل المخطط بشكل نظيف عن الكرة الأرضية الشاحبة وهياكل الدماغ الأخرى. إذا لم يكن المخطط مرغوبا فيه ، فتجاهل الأجزاء الخاصة بالمخطط من التقنيتين

2. حصاد المقطع ، الحصين والقشرة ، تقنية # 1

1. ضع الدماغ كله على قالب المصرفة ، الجانب البطني لأعلى. ضع شفرة حلاقة واحدة من خلال الجزء الأمامي من الدماغ (من خلال الجهاز الشمي الأمامي).
2. أدخل شفرة حلاقة أخرى خلف الشفرة الأولى مباشرة لإنشاء شريحة 0.5 مم ووضع شفرة حلاقة إضافية خلف هذه الشفرة.
3. انقل هذه الشرائح إلى طبق بتري مع sACSF الكربوهيدراتي المؤكسج وضع باقي الدماغ في طبق منفصل مع sACSF. انقل الشرائح المخططة إلى نطاق تشريح لتصور المخطط. يجب أن تحتوي هذه الشرائح على أجزاء كبيرة من المخطط الأمامي وتفتقر إلى الحصين. استخدم نطاق تشريح الفلورسنت مع Nkx2.1-Cre ^+/- ؛ Ai9 ^+/- شرائح للتمييز بين إشارة tdTomato المخططة الضعيفة من إشارة tdالطماطم القوية للكرة الشاحبة.
4. مع أو بدون مضان ، قم بقرص المخطط من نصفي الكرة الأرضية في جميع الأقسام وانقل القطع المخططة إلى أنبوب 50 مل المسمى بشكل صحيح مع sACSF ، وتخزينه على الجليد.
قم
5. بتقطيع الدماغ على طول خط الوسط باستخدام ملقط أو شفرة حلاقة ووضع نصف الكرة الأرضية بحيث يكون السطح الإنسي متجها لأعلى.
6. قم بإزالة أنسجة المخ البطنية (المهاد ، العقد القاعدية ، إلخ) عن طريق الضغط على هذا النسيج بالملقط. عند اكتماله ، يجب أن يكون الحصين (هيكل على شكل سجق يمتد على المحور الأمامي الخلفي على طول القشرة الظهرية) والجانب البطيني من القشرة مرئيا بوضوح.
7. لإزالة الحصين ، أدخل أطراف الملقط أمام الحصين الأمامي وافصل الحصين برفق عن القشرة عن طريق تحريك الملقط للخلف والقرص على طول حدود الحصين القشرية. انقل الحصين المعزول إلى أنبوب 50 مل المسمى بشكل صحيح باستخدام sACSF ، وقم بتخزينه على الثلج.
8. لتشريح القشرة ، ضع الجانب الإنسي للقشرة المنصفة لأسفل. ثم استخدم الملقط لقرص معظم الأجزاء الظهرية والبطنية والأمامية والخلفية من القشرة لترك قطعة مربعة من القشرة الحسية الجسدية الإنسية ، ~ 2 مم × 2 مم. اقلب القشرة بحيث يكون الجانب الإنسي لأعلى ونظيفا من أي أنسجة زائدة غير قشرية (المهاد ، العقد القاعدية ، إلخ) على السطح الإنسي إذا لزم الأمر. انقل قطعة القشرة إلى أنبوب 50 مل المسمى بشكل صحيح باستخدام sACSF ، وقم بتخزينه على الثلج.
9. كرر الإجراء مع نصف الكرة الآخر لجمع كل من مناطق الحصين والقشرة.
10. كرر هذا الإجراء لجميع الجراء ، مع التأكد من استبدال sACSF في أطباق بتري بين الجراء للتأكد من بقاء sACSF باردا وطازجا.

3. حصاد Striatum و Hippocampus و Cortex ، تقنية # 2

1. ضع الجانب البطني للدماغ لأسفل في طبق بتري مغطى ب sylgard يحتوي على sACSF وقم بتثبيته من خلال المخيخ والقشرة الأمامية أو المصابيح الشمية.
2. بدءا من نصف الكرة الأرضية ، استخدم ملقطا منحنيا لفصل القشرة الخلفية برفق عن الحصين الأساسي والأنسجة الأخرى. ضع القشرة المقشرة برفق على طبق بتري. كرر ذلك لنصف الكرة الآخر. يجب أن يكون الحصين والمخطط مرئيين بوضوح في الدماغ المكشوف.
3. استخدم الملقط لقرص حصين واحد عند خط الوسط وتقشير الحصين بشكل جانبي لإزالته. ضعها في قارورة تجميع على الثلج وكرر العملية مع الحصين الآخر.
4. بالنسبة للمخطط ، اكشط برفق حول حواف المخطط لفكه من الأنسجة المحيطة. ثم قم بإزالة المخطط عن طريق قرصه من الأسفل وإضافته إلى أنبوب التجميع على الجليد. كرر مع المخطط الآخر.
5. يمكن حصاد المقاطع القشرية كما هو موضح في الخطوة 2.8.
6. إذا كنت تستخدم خط فأر مراسل معدل وراثيا (على سبيل المثال ، Nkx2.1-Cre ؛ Ai9 ، Lhx6-GFP ، إلخ) ، انقل المخطط إلى طبق بتري باستخدام sACSF واعرضه تحت نطاق تشريح الفلورسنت. استخدم الملقط لإزالة أي نسيج غير مخطط من المخطط (في Nkx2.1-Cre; Ai9 الفئران ، قم بإزالة جميع الأنسجة "الساطعة" ، حيث أن الكرة الشاحبة لديها درجة عظمة عقدية وسطية أعلى بكثير أو مشتقة من MGE ، tdTomato+ كثافة الخلايا مقارنة بالمخطط). كرر لجميع المخططات.
7. كرر هذا الإجراء لجميع الجراء ، مع التأكد من استبدال sACSF في أطباق بتري بين الجراء للتأكد من بقاء sACSF باردا وطازجا.

4. توليد تفكك خلية واحدة

1. بعد اكتمال التشريح ، قم بإعداد محلول 1 مجم / مل بروناز بوزن 10 مجم بروناز وإذابته في 10 مل من sACSF الكربوهيدراتية المؤكسجة.
2. انقل الأنسجة من قوارير التجميع سعة 50 مل إلى أنابيب سفلية مستديرة سعة 5 مل تحتوي على 2 مل من محلول Pronase-sACSF. احتضان الأنسجة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مع رج / تحريك الأنبوب 3-4 مرات بإصبعك أثناء الحضانة لخلط العينات.
3. خلال هذه الحضانة ، قم بإعداد محلول إعادة التكوين: 1٪ مصل بقري جنيني (FBS ، 100 ميكرولتر) + DNAse (1 ميكرولتر من 1: 10،000 مخزون DNAse) في 10 مل sACSF كربوهيدراتي مؤكسج.
4. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة محلول البروناز بعناية حتى لا يزعج الأنسجة الموجودة في الأسفل واستبدله ب 1-2 مل من محلول إعادة التكوين (يعتمد الحجم الكلي على كمية البداية من الأنسجة).
5. قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا عن طريق خلية الأنسجة باستخدام ماصات باستور المصقولة مسبقا بالحريق. بدءا من الماصة ذات التجويف الكبير (~ 600 ميكرومتر) ، قم بشفط وطرد محلول الأنسجة عشر مرات على الأقل لتفتيت الأنسجة. لا تدخل الفقاعات في المحلول. كرر هذه العملية مع الماصة ذات التجويف المتوسط والماصة ذات التجويف الصغير. يجب أن يكون المحلول غائما ، ويجب ألا تكون هناك قطعة واضحة من الأنسجة مرئية في أنابيب التجميع.
6. يقوم بتحريك محلول تحلل الخلية من خلال مرشح 50 ميكرومتر إلى أنابيب مخروطية سعة 5 مل لإزالة أي كتل خلايا. تابع هذه المحاليل أحادية الخلية لقياس التدفق الخلوي (أو ربما مباشرة إلى عد الخلايا إذا لم تكن هناك حاجة إلى الفرز).

5. تحضير محاليل الخلايا المنقاة بفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للزرع

1. عند تلقي محاليل الخلية من مقياس التدفق الخلوي ، انقل المحلول إلى أنبوب مخروطي واحد (أو متعدد) سعة 1.5 مل وقم بتدوير الخلايا عند 500 جم لمدة 5 دقائق عند 4^درجاتمئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الوسائط بحيث يبقى ~ 20-40 ميكرولتر في الأنبوب. أعد تكوين الخلايا في هذه الوسائط المتبقية (وجمع المحلول إذا كانت هناك حاجة إلى أنابيب متعددة).
2. على قطعة صغيرة من البارافيلم ، اخلطي 2 ميكرولتر من محلول الخلية + 8 ميكرولتر sACSF + 10 ميكرولتر من صبغة التريبان الزرقاء. Pipet 10 μL في مقياس كثافة الدم مع غطاء منزلق.
3. احسب عدد الخلايا الحية في كل شبكة مربعة مقاس 4 × 4 في زوايا مقياس الدم باستخدام عداد إحصاء يدوي قياسي في المختبر (ستكون الخلايا الميتة زرقاء من الصبغة) وقم بحساب متوسط هذه الأعداد الأربعة. اضرب هذا الرقم في 100 لتحديد عدد الخلايا لكل ميكرولتر.
4. إذا لزم الأمر ، اضبط مستوى الصوت بحيث تكون الخلايا بتركيز 10,000-30,000 خلية / ميكرولتر في محلول إعادة التكوين. يعتمد التركيز النهائي على الكمية الإجمالية للخلايا والعدد المطلوب من عمليات الزرع. احتفظ بالخلايا على الجليد للزرع

6. الزرع في P0-2 WT

P:

1. لف جروا من النوع البري (WT) في بعض البارافيلم أو القفاز وضعه مغطى جيدا تحت الجليد. اضبط مؤقتا لمدة 5 دقائق وابدأ تشغيله. بعد ذلك الوقت ، قم بإزالة الجرو وتأكد من أنه لا يستجيب لقرص المخلب الخلفي.
2. أثناء وجود الجرو على الجليد ، امزج محلول الخلية عن طريق ماصته عدة مرات للتأكد من خلط تعليق الخلية جيدا قبل التحميل (امزج الخلايا قبل تحميل الماصة الدقيقة لكل حقنة). ثم أفرغ الماصة الدقيقة من الزيت المعدني واملأها بالكامل بتعليق الخلية.
3. ضع الجرو المخدر على طبق بتري مع وضع رأسه على المعجون اللاصق بحيث يكون الجزء العلوي من الرأس مسطحا نسبيا. ضع الشريط مع الفتحة الماسية عبر رأس الجرو ، واسحبه مشدودا للتأكد من شد الجلد وثباته ولكن الفأر مرتاح ويتنفس جيدا. يجب أن تكون لامدا مرئية من خلال ثقب الماس.
4. حرك الجرو الآمن أسفل Nanoject وقم بخفض الماصة الدقيقة بحيث يكون طرف الماصة الدقيقة فوق لامدا مباشرة. سجل إحداثيات xy على المناور.
5. اضبط مقابض المناور لتحريك الماصة الدقيقة إلى الإحداثيات المطلوبة على طول المحور الأوسط الوحشي والأمامي الخلفي للرأس: القشرة الحسية الجسدية الأولية أو S1 Cortex → 1.0 مم أمامي و 1.0 مم جانبي، الحصين → 0.75-1.0 مم أمامي و 1.0-1.2 مم جانبي، → المستقيم 2.0-2.2 مم الأمامي و 1.5 مم جانبي. يمكن تعديل الإحداثيات قليلا للتعويض عن عمر الجرو (على سبيل المثال ، P0 مقابل P2) أو سلالة الفئران (على سبيل المثال ، فئران CD1 أكبر من و C57 / B6 في P2).
6. اخفض الماصة الدقيقة حتى تشكل تقعر صغير على الجلد. ثم أدر مقبض مناور المحور z بقوة ولكن برفق لدفع الماصة الدقيقة عبر الجلد والجمجمة لدخول الدماغ. عندما تدخل الماصة الدقيقة إلى الدماغ ، سيتم تحرير الضغط على الجمجمة وسيختفي التقعر.
7. اسحب الماصة الدقيقة قليلا حتى يحيط بطرفها مخروط من الجلد على شكل خيمة. اقرأ الإحداثيات على طول المحاور z: ستكون هذه هي نقطة الصفر للمحور z.
8. اخفض الماصة الدقيقة إلى العمق المطلوب: → القشرة 0.75-1.0 مم ، الحصين → 1.2-1.5 مم ، → Striatum 2.0-2.5 مم. يمكن تعديل العمق قليلا للتعويض عن عمر الجرو أو إجهاده.
9. حقن معلق الخلية باستخدام برنامج Nanoject III الموضح أعلاه. بعد اكتمال برنامج الحقن، انتظر من 15 إلى 20 ثانية قبل سحب الماصة الدقيقة ببطء لتقليل تسرب المحلول من موقع الحقن.
10. في حالة إجراء الحقن الثنائي ، أعد صفر الماصة الدقيقة فوق لامدا وانتقل إلى الإحداثيات المناسبة في نصف الكرة الآخر. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء إجراء حقنتين في قشرة نفس نصف الكرة الأرضية عن طريق تحريك الماصة الدقيقة 1 مم أمام الحقنة الأولى.
11. بمجرد اكتمال عملية الزرع ، قم بإزالة الشريط وانقل الجرو إلى وسادة التدفئة. إذا لزم الأمر ، ضع علامة على الجرو عن طريق قص الذيل أو إصبع القدم. بمجرد أن يستعيد الجرو اللون الأحمر ويتحرك ، ضعه مرة أخرى في القفص مع الأم.

المواد