تعداء العقد الجذرية الظهرية للفأر بوساطة التثقيب الكهربائي لتعزيز تجديد المحور العصبي الحسي

الملخص

المصدر: Li، Q. et al. التحقيق في تجديد المحور العصبي للثدييات: في الجسم الحي التثقيب الكهربائي للعقدة الجذرية الظهرية للفأر البالغ. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تعداء الخلايا العصبية DRG للفأر بوساطة التثقيب الكهربائي لدراسة تجديد المحاور العصبية. يحدد خطوات توصيل تركيبات الحمض النووي إلى الخلايا العصبية DRG ، وإحداث إصابة العصب الوركي ، وتقييم التجديد المحوري.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. العقدة الجذرية الظهرية (DRG) Tحقن
   1. حقن محلول مخدر (مخفف أفيرتين في محلول ملحي معقم بتركيز نهائي قدره 20 ملغم/مل، مع أفيرتين 200 ملغ/كغ من وزن الجسم) داخل الصفاق للحفاظ على التخدير قبل حقن DRG.
   2. قم بتحميل بلازميدات الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) أو أوليغوس الحمض النووي الريبي (RNA) (1 ميكرولتر لكل DRG) في الماصة الشعرية الزجاجية.
   3. أدخل طرف الماصة الزجاجية الشعرية بعناية في DRG.
   قم
   4. بحقن محلول 1.0 ميكرولتر تدريجيا من بلازميدات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي oligos في DRG باستخدام أنظمة توزيع الحقن المجهري داخل الخلايا (30 رطل لكل بوصة مربعة ، 8 مللي ثانية).
      ملاحظة: يجب ألا تقل مدة الحقن عن 5 دقائق.
2. التثقيب الكهربائي<ol style='list-style-type:decimal;'>
3. قم بإسقاط المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) على أطراف الأقطاب الكهربائية.
4. نظف النزيف بشاش قطني مربع معقم.
5. اضغط على DRG المستهدف باستخدام الأقطاب الكهربائية برفق وقم بتطبيق 5 نبضات كهربائية مربعة باستخدام نظام التثقيب الكهربائي.
6. أغلق طبقات العضلات والجلد ب 5-0 خيوط نايلون ، على التوالي.
7. ضع الفأر على بطانية ساخنة (35.0 درجة مئوية) تحت عناية فائقة حتى يستعيد وعيه الكافي تماما للحفاظ على الاستلقاء القصي. أعد الماوس إلى قفص المنزل بعد أن يتعافى تماما من التخدير.
   ملاحظة: يستغرق الماوس حوالي 60 دقيقة ليتعافى تماما من التخدير على بطانية 37 درجة مئوية. قم بإذابة حبة واحدة (200 مجم) من الإيبوبروفين في 1,000 مل من الماء (0.2 ملغ/مل) للتغذية اليومية لتخفيف آلام ما بعد الجراحة.

سحق العصب الوركي

1. يومين أو ثلاثة أيام (حسب التصميم التجريبي) بعد التثقيب الكهربائي DRG, تخدير الفأر داخل الصفاق مع محلول التخدير (مع أفيرتين 400 ملغ/كغ من وزن الجسم).
2. قم بلصق الأطراف الأربعة للفأر على لوح الفلين.
3. قم بعمل شق 1 سم 0.5 سم إلى الجانب الأيسر على طول خط الوسط. قطع العضلات, مثل الألوية الكبيرة العضلة والعضلة الكمثري, طوليا. كشف جزء من العصب الوركي بين الثقبة الوركي الأكبر والشق الوركي.
4. سحق العصب باستخدام ملقط الجراحة المجهرية لمدة 12 ثانية وقم بتمييز موقع السحق بخيط نايلون 10-0. اصنع عقدة على الغشاء الجافوي لتحديد موقع السحق.
5. أغلق طبقات العضلات والجلد بخياطة 5-0 من النايلون.
6. ضع الفأر على بطانية ساخنة (35.0 درجة مئوية) بعناية فائقة حتى يستعيد وعيه الكافي تماما للحفاظ على الاستلقاء القصي. أعد الفأر إلى قفص المنزل بعد أن يتعافى تماما من التخدير.
   ملاحظة: يستغرق الماوس حوالي 60 دقيقة ليتعافى تماما من التخدير على بطانية 37 درجة مئوية. قم بإذابة حبة واحدة (200 مجم) من الإيبوبروفين في 1,000 مل من الماء (0.2 ملغ/مل) للتغذية اليومية لتخفيف آلام ما بعد الجراحة.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ECM 830 نظام التثقيب الكهربائي للموجة المربعةBTX Harvard Apparatus45-0052ل في الجسم الحي الكهربائيةTweezertrodes أقطابBTX Harvard Apparatus45-0524ل in vivo electroporation ، 1 مم مسطحةPicospritzer IIIParker Instrumentation1096أنظمة الاستغناء عن الحقن المجهري داخل الخلاياالشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتWorld Precision Instruments، Inc.1902328 مجهر تشريح ستيريوLeicaM80 ملقط الجراحة المجهريةFST بواسطة DUMONT ، سويسرا11255-20فقط لسحق العصب الوركيGlass CapillaryWorld Precision Instruments، Inc.TW100-410 سم ، شريط حائط قياسيFisherbrand15-901-30لتثبيت الماوس على لوح الفلين2 ، 2 ، 2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-AldrichT48402محلول مخزون Avertin2-methyl-2-butanolSigma-Aldrich152463 محلول مخزون AvertinsiRNA التحكم السلبي العالمي الفلورسنت # 1Sigma-AldrichSIC003siRNA غير المستهدف معmicroRNA الفلوري تقليد التحكم في التعدي مع Dy547DharmaconCP-004500-01-05microRNA غير المستهدف معطقم تحضير البلازميدات المضان Invitrogen PurelinkK210016تحضير بلازميد ترميز GFPصبغة خضراء سريعةMillipore-SigmaF7252لتصور أفضل لمخطط DRG أثناء الحقنKetaminePutney، IncNDC 26637-731-51تحريض التخديرXylazineAnaSedNDC 59399-110-20تحريض التخديرأسيتامينوفينMcNeil Consumer HealthcareNDC 50580-449-36تخفيف الآلام بعد الجراحة