القياس الكمي للأشواك المتغصنة باستخدام التصوير المجهري متحد البؤر

Abstract

المصدر: Gouder, et. al. القياس الكمي ثلاثي الأبعاد للأشواك المتغصنة من الخلايا العصبية الهرمية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تصوير وتحليل العمود الفقري المتغصني في الخلايا العصبية الهرمية المنقولة ذات العلامات المناعية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يتم تقليل ضوضاء الخلفية ، ويتم تتبع التشعبات من خلال تقدير قطرها وطولها. يتضمن التجزئة الآلية للعمود الفقري تحديد معلمات أبعاد التغصنات والعمود الفقري وتصنيف العمود الفقري. يتم إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد وتصديره للتحليل.

Protocol

1. الثقافة العصبية

1. عالج ألواح الثقافة المكونة من 6 آبار بأغطية زجاجية مع بولي أورنيثين (مخفف إلى 1/6 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ، تركيز المخزون 0.01٪) بين عشية وضحاها (O / N) ، متبوعا بثلاث غسلات في DPBS. ثم أضف اللامينين (تركيز المخزون 1 مجم / مل ، مخفف 500 مرة في DPBS) لمدة 10 ساعات على الأقل تحت غطاء التدفق.
2. صفيحة وإرسال الخلايا الجذعية العصبية (NSC) بكثافة منخفضة (50,000 خلية / سم 2) في ألواح استزراع 6 آبار مع أغطية زجاجية في 3 مل من وسط الاستزراع يتكون من خليط النسر المعدل / خليط المغذيات F-12 أو DMEM / F12 (500 مل) ، قارورتان (5 مل لكل منهما) من مكمل N2 ، قارورتان (10 مل لكل منهما) من مكمل B27 ، 10 مل من Pen-Streptomycin (البنسلين = 10,000 وحدة / مل والستربتومايسين = 10,000 وحدة / مل) ، 1 مل من 2-mercaptoethanol (محلول المخزون: 50 مل) واللامينين (1/500) ، بدون عوامل النمو.
   خطوة حرجة: قم بهذه الخطوة بعناية عن طريق إضافة خلايا ذات حركات دوارة بطيئة لتقليل تجمع الخلايا.
3. قم بإزالة وسط الثقافة. أضف وسط N2B27 الطازج الذي يحتوي على 2 ميكروغرام / مل من محلول اللامينين الطازج للحفاظ على الخلايا العصبية متصلة بالغطاء الزجاجي وتجنب التكتل. قم بتغيير الوسيط كل 3 أيام. احتفظ ببعض الوسط المتبقي (200 ميكرولتر) قبل إضافة وسط جديد لمنع الخلية من الجفاف. بدلا من ذلك ، تابع بسرعة وقم بتغيير الحجم الكلي (3 مل).

2. ملاحظة نقل الفيروسات العدسية

: يتم تشغيل تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) بواسطة محفز كيناز الفوسفورجليسيرات (PGK) للفأر. في هذه الدراسة ، كان العيار الفيروسي 400 نانوغرام / ميكرولتر (محلول مخزون في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1x).

1. تحويل الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن الإنسان أو الخلايا العصبية المشتقة من iPSC في أي خطوة من خطوات النضج بواسطة الجسيمات الفيروسية عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون الذي يحتوي على 40 نانوغرام من ناقل الفيروسات الكريهة GFP لكل بئر مزرعة (ألواح 6 آبار) واحتضانها لمدة 48 ساعة في وسط مزرعة طازجة. ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، تسمح مدة الحضانة بوضع العلامات الجيدة على هياكل العمود الفقري.

3. ملاحظة التألق المناعي

: من أجل تحسين وضع العلامات على مورفولوجيا العمود الفقري بالكامل ، تم إجراء وضع العلامات على التألق المناعي باستخدام جسم مضاد مضاد ل GFP في ظروف نفاذية.

1. قم بإزالة وسط الاستزراع وقم بتثبيت الخلايا المنقولة على أغطية في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو RT ، ثم اغسلها 3 مرات في 1x PBS (10 دقائق لكل منهما).
2. اغمر الأغطية في PBS مع 0.05٪ تريتون (100x) و 10٪ مصل حصان لمدة ساعة واحدة في RT ، ثم اغسلها 3 مرات في 1x PBS.
3. أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS مكملا بمصل الحصان بنسبة 4٪ والجسم المضاد الأولي (1 / 1,000) مرفوعا مقابل GFP ومخففا بمعامل 1,000 على كل غطاء. احتضن في صندوق مظلم O / N عند 4 درجات مئوية ، ثم اغسله 3 مرات باستخدام 1x PBS.
4. تمييع الجسم المضاد المترافق Alexa Fluor 488 (1/200) في PBS مكمل بنسبة 0.5٪ Tween 20 واحتضانه لمدة ساعة واحدة في RT. بعد ذلك ، اغسل 3 مرات في 1x PBS وقم بتركيب أغطية على شرائح زجاجية مع وسيط تركيب للفحص المجهري الفلوري.

4. تصوير العمود الفقري الشجيري

1. إجراء التصوير متحد البؤر من خلال مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر.
2. حدد الخلايا العصبية السليمة ذات التشكل الهرمي والشجرة الشجيرية الكاملة ، وحدد ما لا يقل عن 10 خلايا عصبية لكل حالة من تجارب منفصلة. تحديد 60 - 100 ميكرومتر لكل تغصنات.
3. احصل على صور باستخدام هدف 40X زيت NA = 1.3 وخط ليزر 488 نانومتر لإثارة GFP ، مع قوة ذروة نموذجية على مستوى العينة حوالي 20 ميكروواط. اضبط حجم البكسل حوالي 80 نانومتر لأخذ عينات من العمود الفقري المتغصن بشكل صحيح.
   ملاحظة: يستدعي التحليل اللاحق صورة لا تؤثر فيها الضوضاء على التجزئة المناسبة للتشعبات والأشواك. من خلال أخذ العينات المكانية وإعدادات الطاقة المذكورة أعلاه ، لاحظنا أن وقت بقاء البكسل البالغ 3.15 ميكرو ثانية يكفي لجمع ما يكفي من الفوتونات لبناء مثل هذه الصورة. بالنسبة للعينات الخافتة ، يمكن تحسين جودة الصورة بمتوسط 2 إلى 4 عمليات مسح. قد تكون هناك حاجة إلى اقتناء العديد من مربعات XY لتغطية منطقة الاهتمام ، والتي يجب بعد ذلك تجميعها معا قبل المعالجة.
4. لأخذ عينات من حجم الخلايا العصبية بالكامل ، احصل على مكدس Z بتباعد Z يتراوح من 150 نانومتر إلى 300 نانومتر ، مما ينتج عنه 20 إلى 30 شريحة Z.
   ملاحظة: الدقة المكانية الجانبية التي تم تحقيقها باستخدام هذه الإعدادات هي 234 نانومتر ، والدقة المحورية هي 591 نانومتر. أخذ العينات المختارة هنا كاف ، ولكن نظرا لأن الدقة المحورية أكبر من أصغر حجم للأشواك المراد تصويرها ، فإن التحليل يفضل العمود الفقري الذي يمتد بشكل جانبي من التشعبات.

5. 3D القياس الكمي للأشواك المتغصنة

ملاحظة: تصف الأقسام التالية على وجه التحديد استخدام برنامج Imaris للتحليل. توجد تطبيقات بديلة ، بما في ذلك NeuronStudio أو Metamorph ، والتي يمكن أن توفر نتائج مماثلة.

استخدم الإعدادات الرئيسية التالية:

1. كمرحلة ما قبل المعالجة ، يتم استخدام التصفية الغوسية من خلال مرافق معالجة الصور التي يوفرها البرنامج. قم بإجراء التصفية الغوسية عبر معالجة الصور > تنعيم > مرشح Gaussian. قم بتعيين عرض المرشح ليكون مساويا لحجم البكسل في XY.
2. قم بإجراء تتبع شبه تلقائي للتشعبات باستخدام وحدة Filament Tracer الخاصة بالبرنامج.
   1. أولا، قم بتقدير قطر التغصنات باستخدام أداة المسافة في علامة التبويب Slice في البرنامج.
   2. في علامة التبويب تجاوز ، انقر فوق أداة Filaments. للحصول على متانة أفضل ، يعتمد هذا البروتوكول على التتبع شبه الآلي. انقر فوق تخطي الإنشاء التلقائي. تعرض واجهة الوحدة النمطية الآن علامة التبويب رسم. هنا ، حدد AutoPath كطريقة ، والتغصنات كنوع ، وأدخل قطر التغصنات المقدر.
   3. استخدم وضع تحديد المؤشر، وتحويل المؤشر إلى مربع. انقر بزر الماوس الأيمن على نقطة بداية التغصن. ملاحظة: يقوم البرنامج بإجراء العمليات الحسابية الأولية.
   4. حرك المؤشر على طول التغصن. من نقطة البداية (ممثلة على شكل كرة زرقاء) ، يظهر خط أصفر يمثل مسار التغصنات الأكثر احتمالا. انقر مع الضغط على زر الماوس الأيسر على نقطة نهاية التغصن.
3. قم بإجراء تجزئة العمود الفقري الآلي. ملاحظة: يمكن العثور على العمود الفقري الموجود على التغصنات المتتبعة تلقائيا بواسطة واجهة الوحدة.
   1. في واجهة الوحدة النمطية، انقر فوق علامة التبويب إنشاء. في القائمة المنسدلة إعادة البناء، اختر إعادة بناء قطر التغصنات وحدد مربع الاحتفاظ بالبيانات. ثم انقر فوق إعادة إنشاء.
   2. قم بتعيين العتبة بحيث يتوافق الحجم المجزأ مع حجم التغصنات الفعلي. كخوارزمية، حدد أقصر مسافة من خريطة المسافة. انقر فوق الزر التالي.
   3. حدد أصغر قطر لرأس العمود الفقري والحد الأقصى للطول ، مرة أخرى باستخدام أداة المسافة في علامة التبويب Slice في البرنامج ، ثم ارجع إلى علامة التبويب Transpass وأدخل المعلمات. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تعد القيم حوالي 200 - 300 نانومتر للقطر الأدنى و 4 ميكرومتر للطول الأقصى نقاط انطلاق جيدة. لا تقم بتحديد مربع السماح بالعمود الفقري الفرعي. انقر فوق الزر التالي.
   4. اضبط عتبة النقاط الأولية بحيث يتم ترجمة النقاط الزرقاء التي تمثل الأشواك إلى رؤوس العمود الفقري الفعلية. انقر فوق الزر التالي. ملاحظة: يتم إجراء الحساب الأساسي الآن ويمكن أن يكون طويلا.
4. قم بتصنيف العمود الفقري بالانتقال إلى علامة التبويب "أدوات" في واجهة الوحدة النمطية. انقر فوق تصنيف العمود الفقري. في واجهة المستخدم المطلوبة ، تأكد من وجود أربع فئات ، محددة من خلال مورفولوجيتها على النحو التالي: قصير: الطول <1 ميكرومتر ؛ الفطر: الطول (العمود الفقري) >3 وأقصى عرض (الرأس) >متوسط العرض (الرقبة) × 2 ؛ طويل رفيع: متوسط العرض (الرأس) ≥ متوسط العرض (الرقبة) ؛ يشبه فيلوبوديا: الطول ≤ 4 ميكرومتر (بدون رأس). ملاحظة: تقوم واجهة الوحدة النمطية بإنشاء أربعة كائنات خيوط جديدة تحتوي على نتائج التصنيف.
5. تصدير البيانات الإحصائية: في أي من واجهات الكائنات الأربعة هذه ، انتقل إلى علامة التبويب الإحصائيات. انقر فوق الزر تصدير جميع الإحصائيات إلى ملف.
   ملاحظة: يمكن تصدير قيم إحصائية أخرى للتشعبات (على سبيل المثال ، الطول ، المساحة ، متوسط القطر ، عمق الفرع ، زاوية التفرع ، الحجم ، إلخ) والعمود الفقري (على سبيل المثال ، الاستقامة ، ومساحة التعلق ، وطول وحجم أجزاء العمود الفقري المميزة ، قطر العمود الفقري ، الكثافات ، إلخ).

Materials