توصيل الفيروسات داخل القراب في نموذج الفأر لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي

الملخص

المصدر: Li, D., et al. الحقن المباشر داخل القراب للفيروسات المؤتلفة المرتبطة بالغة في الفئران البالغة. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو إجراء الحقن داخل القراب للفيروسات المرتبطة بالغدة (AAV) في السائل النخاعي (CSF) للفأر المستيقظ ، ويغطي تحضير المحقنة ، ومحاذاة العمود الفقري ، وإدخال الإبرة بدقة. تتحقق هذه الطريقة من صحة توصيل الجينات المستهدفة ، مما يدعم إمكاناتها لعلاجات الجهاز العصبي المركزي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير محلول مخزون هيدروكلوريد الليدوكائين بنسبة 20

٪

1. وزن 2 جم من هيدروكلوريد الليدوكائين. أضف 5-6 مل من الماء المعقم والدوامة برفق. قم بزيادة الحجم إلى 10 مل بالماء المعقم.
2. 1.2 قم بتصفية محلول المخزون من خلال مرشحات 0.2 ميكرون. Aliquot محلول المخزون ، 1 مل لكل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وأغلقه بغشاء مانع للتسرب. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. التوصيل المباشر داخل القراب في الفئران المستيقظة

1. امسح منطقة العمل باستخدام شاش معقم يحتوي على 70٪ من الإيثانول وقم بإعداد المستلزمات المطلوبة.
2. قم بإعداد 100 ميكرولتر من مركب هيدروكلوريد الليدوكائين AAVrh.10 / 1٪ عن طريق إضافة 95 ميكرولتر من محلول مخزون rAAVrh10 (5 × 10¹² نسخة جينوم / مل) في أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 200 ميكرولتر ، وأضف 5 ميكرولتر من محلول مخزون هيدروكلوريد الليدوكائين بنسبة 20٪. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، قم بتخزين محلول الفيروس على الجليد (4 درجات مئوية).
   ملاحظة: سيتم استخدام 8 ميكرولتر لكل ماوس.
3. تحضير المحقنة بمحلول AAV للحقن
   1. قم بتجميع حقنة هاميلتون سعة 25 ميكرولتر بإبرة 27 G وقم بمحاذاة الطرف المشطوف للإبرة مع المقياس الحجمي على المحقنة.
   2. ارسم 8 ميكرولتر مع 4 × 10¹⁰ نسخ جينوم من محلول الفيروس في المحقنة برفق. تأكد من إزالة فقاعات الهواء.
4. تحضير الفأر
   ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة ذكور أو إناث فئران FVB / NJ (30-70 يوما). تم إجراء حقن تكنولوجيا المعلومات في غطاء المحرك.
   1. تعقيم منطقة العمل في غطاء يحتوي على 70٪ من الإيثانول. ضع الفأر المستيقظ (ذكر أو أنثى ، 30-70 يوما ، وزن 13-20 جم) على قطعة سرير في وضع الانبطاح في غطاء المحرك. قم بتغطية الجزء العلوي من الجسم بشاش معقم لتهدئة الفأر وتجنب التعرض للعض.
   2. قم بإصلاح عن طريق الإمساك بشكل مناسب وبثبات على حزام الحوض بإبهام على جانب واحد والسبابة / الإصبع الأوسط على الجانب الآخر. حافظ على الجلد بين مشدات الحوض الثنائية بالإبهام والسبابة. امسك برفق على الجزء العلوي من جسم براحة اليد.
   3. احلق الفراء على ظهره بين مشدات الحوض الثنائية ، ثم عقم سطح الجلد بمقشر قائم على اليوديد و 70٪ إيثانول.
5. الحقن داخل القراب
   1. تحسس المساحة الفقرية على طول الخط الأوسط بين مشدات الحوض الثنائية بإبهام أو سبابة من اليد الأخرى واضغط على مسافة بادئة بأظافر للإشارة إلى المساحة الفقرية L5-L6 (حدد موقع الحقن).
   2. قم بتدوير قاعدة الذيل قليلا وبرفق للإشارة إلى خط الوسط للعمود الفقري. اضبط شطبة الإبرة باتجاه رأس قبل الحقن.
   3. تأكد من تثبيت بإحكام ، وقم بمحاذاة الإبرة على طول خط الوسط للعمود الفقري.
   4. أدخل الإبرة برفق وعموديا (أو قم بإمالة 70-80 درجة قليلا) في تقاطع المسافة البادئة ، مع الحفاظ على المحقنة في مستوى سهمي مركزي. قلل الزاوية ببطء إلى حوالي 30 درجة عندما تربط العظم ، ثم انزلق الإبرة في الفضاء الفقري.
      ملاحظة: نفض الغبار المفاجئ الواضح هو علامة على الدخول الناجح إلى الفضاء داخل الجافية. بمجرد دخول الإبرة إلى الفضاء الفقري ، سيشعر طرف الإبرة بتثبيته بإحكام. الإبرة 27 G المستخدمة في هذه الدراسة مناسبة لتوصيل تكنولوجيا المعلومات في الفئران ولكن ليس الفئران.
   5. حقن محلول المتجه. ابدأ المؤقت وحقن 8 ميكرولتر من محلول المتجه بسرعة 1 ميكرولتر/4 ثوان. احتفظ بالإبرة بعد حوالي 1 دقيقة من الانتهاء من التسليم. اسحب الإبرة بدوران لطيف لتجنب التسرب.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات FVB / NJ الفئرانمختبرات تشارلز ريفر الصين ليدوكائين هيدروكلوريد أحادي الهيدراتHEOWNS73-78-9 AAVنواقل الفيروس الأساسية لمركز العلاج الجيني بجامعة كلية الطب بولاية ماساتشوستس 25 ميكرولتر حقنة هاميلتون / 27-30 جرام إبرةGASTIGHT1702 70٪ إيثانولWEN ZHI GauzeWei AN51711128 سم * 10 سم * 12 سم