تصور النقل داخل الخلايا للبضائع في الخلايا النجمية المستزرعة

الملخص

المصدر: Creighton, B. A., et al. تصور وتحليل النقل داخل الخلايا للعضيات والشحنات الأخرى في الخلايا النجمية. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تصور نقل البضائع داخل الخلايا في الخلايا النجمية المستنبتة باستخدام مسبار موجه للحموضة الفلورية يقوم بتسمية الحويصلات الحمضية الحمضية بشكل انتقائي. يسمح التصوير بفاصل زمني والحصول على مكدس Z مع مجهر متحد البؤر بتتبع البضائع ذات العلامات الفلورية في جميع أنحاء حجم الخلية ثلاثي الأبعاد. يميز التحليل البضائع الثابتة عن البضائع التي تتحرك نحو محيط الخلية أو النواة ، مما يوفر رؤى حول ديناميكيات النقل داخل الخلايا.

البروتوكول

1. تعداء البلازميدات ذات العلامات الفلورية

1. في اليوم السابق للتعداء أو وضع العلامات ، الخلايا النجمية للبذور بالكثافة المطلوبة للتصوير بعد 24-48 ساعة بعد التعدين. الكثافة الموصى بها للألواح المكونة من 24 بئرا أو الآبار السفلية الزجاجية 14 مم هي 2 × 104 خلية / بئر.
   ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لتعداء الخلايا النجمية المطلية على أغطية زجاجية مقاس 12 مم على ألواح 24 بئرا أو آبار قاع زجاجية مقاس 14 مم باستخدام طريقة قائمة على تذوق الدهون. يجب تحجيم الكواشف اعتمادا على حجم طبق الاستزراع الذي تنمو فيه الخلايا النجمية.
2. تمييع كاشف الدهون (جدول المواد) في وسط مصل منخفض (جدول المواد). لتحسين نسبة كاشف شفق الدهون إلى الحمض النووي ، اختبر مجموعة من التخفيفات الكافية. على سبيل المثال ، في حالة استخدام الكاشف المستخدم في هذا البروتوكول (جدول المواد) ، قم بتخفيف 2 و 3 و 4 و 5 ميكرولتر من كاشف شفت الدهون في 50 ميكرولتر من وسائط المصل المخفض.
3. تمييع 5 ميكروغرام من الحمض النووي عالي النقاء في 250 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة. أضف 5 ميكرولتر من كاشف محسن الدهون (جدول المواد). اجمع بين الأنبوب الذي يحتوي على كاشف شفق الدهون مع حجم متساو من مزيج محسن الحمض النووي والدهون. تخلط عن طريق سحب العينات وتحتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
4. قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا النجمية وأضف مزيج التعداء (الخطوة 1.3) إلى الخلايا بالتنقيط. بعد حضانة لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، استبدل مركب التعدي بحجم مناسب من وسائط زراعة الخلايا النجمية (2 مل لأطباق القاع الزجاجي 14 مم). احتضن لمدة 24-72 ساعة إضافية قبل الشروع في الحصول على الصورة. راقب عن كثب مدة خطوة الحضانة لتحقيق أفضل توازن بين التعبير عن البروتين وقابلية الخلية للحياة.

2. وضع العلامات على الجسيمات الداخلية / الجسيمات الحالة المتأخرة باستخدام مجسات الفلورسنت

ملاحظة: يمكن تسمية بعض الشحنات باستخدام أصباغ الفلورسنت ذات التقارب العالي للبروتينات الخاصة بالبضائع. يسمح المثال التالي بوضع العلامات على الجسيمات الداخلية المتأخرة / الجسيمات الحالة باستخدام مسبار الفلورسنت الحمضي.

1. قم بتخفيف مسبار الملصقات الليزوزومية (جدول المواد) في 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا النجمية إلى تركيز عمل يبلغ 1 ميكرومتر وتطبيقه على الخلايا النجمية من الخطوة 1.1 بكثافة 2 × 104 خلية / بئر. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
2. اغسل الخلايا مرة واحدة بوسائط زراعة الخلايا النجمية الدافئة واستبدلها بوسائط التصوير (جدول المواد). انتقل إلى التصوير المباشر على الفور.

3. الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير بفاصل زمني

ملاحظة: يجب إجراء التصوير المباشر بفاصل زمني باستخدام مجهر مضان مزود بكاميرا عالية السرعة ، وتركيز محدد ، وغرفة حضانة ، وهدف زيت 40x بفتحة رقمية عالية (على سبيل المثال ، Plan-Apochromat 1.4NA). تتوفر مجموعة متنوعة من برامج الاستحواذ للتصوير بفاصل زمني. يجب أن يعتمد اختيار نظام الفحص المجهري وبرمجيات الاستحواذ على توافرها وملاءمتها لأهداف الدراسة المحددة. وترد أدناه بعض الإرشادات العامة.

1. ضع غرفة أو طبق الثقافة في المحول المناسب على مرحلة المجهر. باستخدام ضوء التألق ، حدد الخلية (الخليات) التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت أو المسبار لتسجيله. اضبط إضاءة عينة الفلورسنت لتصور الخلية (الخلايا) المحددة باستخدام الكاميرا الرقمية. تجنب استخدام الإضاءة العالية التي قد تسبب التبييض الضوئي والسمية الضوئية. ضبط التركيز والتكبير.
2. احصل على سلسلة الفاصل الزمني المفردة Z-stack بتردد 1 إطار كل 2 ثانية للفترات الزمنية التي تتراوح بين 300 ثانية و 500 ثانية باستخدام وظائف التكبير / التصغير والتركيز المحدد.
   ملاحظة: ستختلف ديناميكيات الاتجار (السرعة ، وتردد الحركة ، وما إلى ذلك) اعتمادا على البروتين محل الاهتمام ، وبالتالي ، قد يتطلب المسار الزمني للاكتساب تعديلا. على سبيل المثال ، الميتوكوندريا أقل حركة من الجسيمات الحالة وتظهر توقفات متكررة. في هذه الحالة ، من الأنسب ضبط معلمات الاكتساب على 1 رتل كل 5 ثوان لمدة 800 ثانية.
3. احفظ الصور ذات اللقطات المتتابعة وقم بتصديرها كملفات مكدس AVI أو TIFF.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Dulbecco's Modified Eagle MediumGen Clone25-500 مصل الأبقار الجنينيالجوزاء100-106فيجي المعطلة بالحرارة(فيجي هي مجرد صورة J)المعاهد الوطنية للصحةالإصدار 1.52i ملاقط ذات طرف ناعمFST11254-20نمط # 5مصدر ضوء مضانExcelitas012-63000X-Cite 120Qأطباق قاع زجاجيMattek CorporationP35G-1.5-14-Cطبق 35 مم | رقم 1.5 غطاء | قطر الزجاج 14 مم | ملقط Graefe غير المطليFST11054-10ملقط Graefe Iris بأطراف منحنيةصبغة فلورية خضراء تلطخ المقصورات الحمضية (الجسيمات الداخلية المتأخرة والليزوسومات)Life TechnologiesL7526LysoTracker Green DND 26. مذابة مسبقا في DMSOS إلى محلول مخزون 1 ملم. خفف إلى تركيز العمل النهائي في وسط النمو أو المخزن المؤقت المفضل.محلول الملح المتوازن من هانك (10x) Gibco14065-056تقنيات وسائط التصوير الخالية من المغنيسيوموالكالسيوم A14291DJحل تصوير الخلايا الحيةالمجهر متحد البؤر المقلوبZeiss LSM 780KymoToolBox https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBoxLipofection EnhancerReagentr Life Technologies11514015PlusReagent Lipofection Life Technologies 15338100كاشف Lipofectamine LTXحاضنة اهتزاز مداريةنيو برونزويك Scientific8261-30-1008Innova 4230 ، حاضنة اهتزاز مدارية مع التحكم في درجة الحرارة والسرعةمحلول البنسلين / الستريبوميسين (100x) Gen Clone25-512 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10x) Gen Clone25-507x Poly-D-Lysine HydrobromideSigmaP7405يذوب في مخزن مؤقت تريس ، درجة الحموضة 8.5 ، عند 1 مجم / مل. تجميد للتخزين طويل الأجل. تجنب دورات التجميد والذوبانمتوسط مصل منخفضGibco31985-062قوارير زراعة الأنسجة OPTI-MEMأوليمبوس بلاستيك25-20975 سم ^ 2. وصول الرقبة بزاوية 100٪ ، غطاء مرشح موفر للماء 0.22 ميكرومترحاضنة زراعة الأنسجة51030285HERAcell VIOS 160i ، حاضنة لزراعة الأنسجة مع التحكم في درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربونTris-BaseSigmaT15038.402 جم مذاب إلى لتر واحد في الماء مع 4.829 جم Tris HCl لعمل 0.1 M Tris buffer ، درجة الحموضة 8.5Tris-HClSigmaT32534.829 جم مذاب إلى لتر واحد في الماء مع 8.402 جم Tris Base لعمل 0.1 M Tris buffer ، درجة الحموضة 8.5